Une femme de 52 ans ayant des antécédents de cholécystectomie et de résection partielle du lobe gauche du foie en 2004 en raison d'une symptomatologie de calculs biliaires et de multiples métastases intrahépatiques des voies biliaires a présenté une fièvre intermittente et une jaunisse progressive depuis début novembre 2014. Une obstruction des voies biliaires et une suspicion de tumeur maligne hépatique ont été détectées lors d'une échographie ultérieure, d'une cholangiopancréatographie par résonance magnétique (MRCP), d'une imagerie par résonance magnétique (IRM) et d'une tomographie par émission de positrons (TEP). Une laparotomie exploratoire a été réalisée fin novembre 2014 (Fichier supplémentaire: Figure S1) et a révélé une adhésion intra-abdominale sévère, une masse (1 × 2 cm) à texture indurée dans le conduit hépatique gauche proximal et une dissémination de lésions néoplasiques infiltrant le hile du conduit hépatique commun, le ligament hépato-duodénal, les ganglions lymphatiques environnants, l'artère hépatique, la veine porte et l'axe cœliaque. Ces résultats ont contraint les chirurgiens à renoncer à une résection radicale. Des sécrétions biliaires purulentes ont été évacuées du conduit commun et un bouchon muqueux a dépassé la paroi du conduit biliaire. Des lésions néoplasiques partielles ont été enlevées des ganglions lymphatiques élargis, du noyau du conduit hépatique gauche et de la marge du conduit hépatique commun. Un drainage du conduit T a été installé pour soulager l'obstruction biliaire. Les rapports pathologiques ont révélé que la nature de la tumeur était un adénocarcinome mal différencié avec des marqueurs de différenciation des cholangiocytes; en outre, une expression modérée de l'EGFR a été détectée dans >90 % des cellules tumorales. Cette patiente a finalement été diagnostiquée comme atteinte d'un CCA périhilar inopérable avancé. Cinq semaines après la chirurgie palliative, la patiente a reçu une cure de 4 semaines de thérapie TOMO sur la lésion néoplasique hépatique (DT = 60 Gy/25 F), un cycle de chimiothérapie systématique avec paclitaxel lié à l'albumine pour ses toxicités gastro-intestinales intolérables et la perfusion de cellules tueuses cytokines induites autologues. En raison de l'augmentation progressive de CA199, le PET-CT a été réexaminé immédiatement après l'achèvement de la radiothérapie et a montré une nouvelle lésion hypermétabolique néoplasique dans le lobe caudé hépatique et une augmentation des métastases des tissus mous et des ganglions lymphatiques péritonéaux avec une valeur de standardisation anormale (SUV) entre le foie et l'estomac par rapport au PET-CT avant la radiothérapie. Quatre semaines après la radiothérapie, la patiente a été inscrite à l'essai CART-EGFR. Son état de performance était de 1 selon les critères de l'ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group). Pendant la préparation des cellules CART-EGFR, elle a développé une fièvre élevée, une jaunisse agressive et une obstruction des voies biliaires, accompagnées d'une élévation continue de CA199 (de 100,5 à 413,5 U/ml), d'une augmentation agressive de la bilirubine totale, de la bilirubine directe et d'autres enzymes liées à l'obstruction des voies biliaires et a été traitée avec des antibiotiques à large spectre efficaces et une stent biliaire endoscopique dans les voies biliaires hépatiques. Les essais (identifiant ClinicalTrials.gov NCT01869166, NCT02541370) ont été approuvés par le conseil de révision institutionnel de l'hôpital général de l'armée populaire de Chine. Aucun sponsor commercial n'a été impliqué dans les études. Les patients inscrits ont fourni un consentement éclairé écrit conformément à la déclaration d'Helsinki. La séquence d'ADN du fragment variable de la chaîne simple (scFv) ciblant l'antigène EGFR a été dérivée de JQ306330.1 (numéro GenBank). Le CAR anti-EGFR scFv-CD137-CD3zeta a été généré et cloné dans l'épine dorsale lentivirale pWPT, décrite en détail par Feng et al. []. La construction a été vérifiée par séquençage d'ADN. Un supernatant de vecteur lentiviral pseudo-typé de qualité clinique a été produit par transfection transitoire standard, comme décrit par McGinley et al. [ ] Conformément aux instructions du fabricant pour le réactif de transfection Lipofectamine 3000 (Invitrogen, États-Unis), le plasmide pWPT-anti-EGFR CAR, le plasmide d'encapsulation ps-PAX2 et le plasmide d'enveloppe pMD2.G ont été transfectés dans des cellules 293 T. Les supernatants lentiviraux ont été collectés et conservés à -80 °C. Le vecteur GFP-CD133 a été construit pour vérifier l'efficacité de la transduction au moyen de la cytométrie de flux FACSCalibur (BD Biosciences). La séquence d'ADN du scFv ciblant l'antigène CD133 a été dérivée de HW350341.1 (numéro GenBank), la génération, la construction et le test des cellules CART-EGFR ont suivi la même procédure que les cellules CART-EGFR (Fichier supplémentaire: Figure S2). Les cellules CART ont été fabriquées à partir de cellules mononucléaires de sang périphérique autologues (PBMC) collectées dans des tubes de préparation de cellules (BD Biosciences, San Jose, CA) purifiées à partir de 80 à 100 ml de sang total au sein de l'installation de bonnes pratiques de fabrication du Chinese PLA General Hospital, conformément aux procédures opérationnelles standard en vigueur. Les PBMC ont été stimulées avec 50 ng/ml d'anti-CD3 MoAb (Takara, Japon) et 500 U/ml d'interleukine-2 humaine recombinante (Peprotech, États-Unis) dans le milieu GT-T551 (Takara). La transduction lentivirale a été réalisée dans le milieu GT-T551 avec du sulfate de protamine (Sigma) pendant 24 h après 2 jours de culture de cellules T. Par la suite, les cellules ont été davantage développées dans des sacs de culture (Takara) et récoltées sous forme de cellules CART. Les bactéries, les champignons et les endotoxines ont été testés avant la perfusion de cellules CART. L'immunophénotype des cellules CART a été analysé par cytométrie en flux avec des anticorps marqués par fluorescence spécifiques pour la coloration CD3, CD4, CD8, CD45RO, CD62L et CCR7. Des anticorps monoclonaux appariés par isotype (BD Biosciences) ont été utilisés pour la coloration de contrôle. L'expression de CAR a été estimée sur la base des cellules transduites GFP-CD137-CD3zeta du même lot pour tous les patients par cytométrie en flux. L'acquisition et l'analyse des données ont été effectuées à l'aide d'une cytométrie en flux FACSCalibur (BD Biosciences). La cytotoxicité in vitro des cellules CART-EGFR a été testée par co-culture avec des cellules tumorales EGFR-positives à différents rapports effecteurs-cible dans des plaques à 96 puits en utilisant un kit de détection CCK-8 de 4 h (DOJINDO, Japon). La PCR quantitative en temps réel (Q-PCR) a été utilisée pour évaluer le niveau du gène de fusion CAR selon un protocole décrit précédemment.13 Un fragment de 153 pb (paires de bases) contenant des portions de la chaîne CD8a et de la chaîne 4-1BB adjacente (l'amorce directe 5′-GGTCCTTCTCCTGTCACTGGTT-3′ et l'amorce inverse 5′-TCTTCTTCTTCTGGAAATCGGCAG-3′) a été amplifié par le système de détection de séquences ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems). La bêta-actine a été utilisée comme contrôle interne. Une courbe standard à 7 points composée de 100 à 108 copies/μl d'ADN plasmidique contenant le gène CAR a été préparée. Le sérum IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-12/IL23p40, IFN-γ, TNF-α, VEGF et Granzyme B ont été testés à l'aide d'un immuno-essai sandwich à micro-billes BD Biosciences, conformément aux instructions du fabricant. Selon le système de culture rapporté précédemment [], les cellules CART-EGFR ont été générées à partir des cellules mononucléaires de 80 à 100 ml de sang périphérique du patient et libérées pour les perfusions. Des cellules perfusées au cours du premier cycle de thérapie CART-EGFR, 99,14 % étaient des cellules CD3+, principalement composées du sous-ensemble CD8+ (62,26 %), et 23,61 % étaient caractérisées par le phénotype mémoire central (CD45RO+/CD62L+/CCR7+). En outre, 8,99 % des cellules perfusées étaient positives à l'EGFR. Le phénotype et l'efficacité de transfection des cellules CART-EGFR perfusées à chaque cycle sont documentés dans le tableau. Les cellules CART133 ont été générées et cultivées selon la même procédure que les cellules CART-EGFR. Parmi les cellules infusées, 95,2 % étaient des cellules CD3+ principalement composées du sous-ensemble CD8+ (71,9 %) et 41,9 % étaient du sous-ensemble CD45RO+/CD62L+/CCR7+. En outre, 6,4 % des cellules infusées étaient CD133 positives. Les détails sont documentés dans le tableau. En raison de la radiothérapie récemment terminée dans les 2 mois et de l'intolérance aux agents chimiothérapeutiques, la patiente a reçu des perfusions successives de 4 jours de 2,2 × 106/kg de cellules CART-EGFR en totalité sans aucun traitement préparatoire, et a obtenu un PR lors de sa première évaluation 6 semaines plus tard, évaluée selon les critères d'évaluation de la réponse dans les tumeurs solides version 1.1 (RECIST 1.1) avec IRM et TEP-CT, qui a illustré une réduction de plus de 80 % des lésions métastatiques dans la région hépatico-hilaire et le lobe caudé et une diminution remarquable de SUV, ainsi qu'une diminution rapide de CA199 de 413,5 à 123,1 U/ml. Le nombre de copies du transgène CAR dans le sang périphérique de la patiente a atteint un pic de 5916 pg/dl au jour 9, accompagné d'une libération de cytokines telles que l'interleukine-6 (IL-6) et la protéine C réactive (CRP). Le deuxième cycle de monothérapie CART-EGFR a été administré avec une dose de cellules T CART-EGFR exprimant 2,1 × 106/kg et sans aucun traitement préparatoire, car le nombre de copies du transgène CAR dans le sang périphérique a diminué à un niveau proche de la ligne de base 2 mois après la première perfusion de cellules T génétiquement modifiées exprimant CART-EGFR. Les examens de routine par IRM et TEP-CT ont montré un PR persistant accompagné d'une nouvelle réduction de CA199 à 61,2 U/ml. Il est intéressant de noter que le pic du nombre de copies du transgène CAR après la deuxième perfusion de cellules CART-EGFR n'a pas atteint un niveau parallèle ou supérieur à celui du premier cycle de CART-EGFR. Le statut PR de la patiente a été maintenu pendant 8,5 mois jusqu'à ce qu'elle développe des vomissements fréquents et incontrôlables, des douleurs abdominales supérieures et des reflux gastriques, qui sont survenus à la mi-novembre 2015. L'examen électronique subséquent de l'estomac a montré une sténose du bulbe duodénal et le TEP-CT a confirmé la progression de la tumeur avec l'illustration de plusieurs nouvelles anomalies de SUV dans l'omentum majus, le péritoine et la cavité abdominale. Par la suite, le patient a été traité avec 1 cycle de thérapie CART-EGFR associé à 2 cycles d'anticorps monoclonal anti-PD-1 (Nivolumab, Bristol-Myers Squibb), administré à une dose de 100 mg toutes les 2 semaines. De même, le nombre de copies du transgène CAR surveillé dans le sang périphérique n'a pas atteint un niveau de pic similaire à celui de la première perfusion du cycle, même associé à l'anticorps anti-PD-1. Malgré la baisse transitoire du CA199 sérique de 326,3 à 210,8 U/ml, la PET-CT suivante a détecté de nouvelles métastases dans le bas du bassin, le lobe droit du foie et le ganglion lymphatique supraclaviculaire gauche ainsi que l'élargissement des lésions tumorales antérieures dans l'abdomen par rapport à la PET-CT avant l'immunothérapie combinée. Étant donné que plus de 90 % des cellules tumorales exprimaient la protéine CD133 (Fichier supplémentaire: Figure S3), la patiente a ensuite été inscrite dans l'essai CART133 et a reçu l'injection de 1,22 × 106/kg de cellules CART spécifiques CD133 sans traitement préparatoire. En raison de l'obstruction du duodénum descendant et de l'infection biliaire sévère persistante qui en a résulté, ainsi que de l'abcès du foie, qui peut interférer avec le niveau de CA199 sérique et a été traité avec des antibiotiques, l'évaluation par imagerie prévue a été reportée à 2 mois après l'injection de cellules CART133, au cours de laquelle la TDM à contraste a montré une rétrécissement remarquable ou même la disparition de certaines métastases dans le péritoine et la cavité abdominale, ce qui a conduit à une évaluation de PR. Le nombre de copies du transgène CAR dans le sang périphérique (PB) a fluctué de 377 à 919 pg/dl. La patiente a ressenti une douleur sourde persistante dans la partie supérieure de l'abdomen 2,5 mois plus tard, et le scanner ultérieur a détecté une nouvelle lésion métastatique d'environ 40 × 70 mm sous la paroi abdominale et des métastases présumées dans la cavité abdominale, ainsi qu'une diminution du nombre de copies du transgène CAR dans le PB proche du niveau initial, ce qui a conduit à une conclusion de maladie progressive (PD). Les événements indésirables tels que les frissons, la fièvre, la fatigue, les vomissements et les douleurs musculaires survenant pendant la perfusion des cellules CART-EGFR étaient généralement modérés, tolérables et gérable par des soins de soutien. Cependant, le patient a développé une fièvre inférieure de 9 jours sans frissons, toux, diarrhée ou autres symptômes infectieux à partir du troisième jour suivant la perfusion des cellules CART. L'examen de laboratoire répété du PB a montré un nombre normal de globules blancs, un rapport neutrophile négatif, une procalcitonine négative (PCT) et des cultures sanguines, qui ne soutenaient pas le diagnostic d'infection, mais entre-temps, une escalade de l'IL-6 et de la CRP et une augmentation aiguë de la glutamic-pyruvic transaminase et de la glutamic-oxalacetic transaminase (>6ULN). Il y avait quelques éruptions cutanées dispersées qui sont apparues dans la cuisse gauche 2 semaines après la première perfusion du cycle des cellules CART-EGFR, qui s'est progressivement aggravée et est devenue apparente et prurigineuse avec la présentation de multiples éruptions cutanées squameuses ou linéaires se propageant de la cuisse gauche au mollet et se rejoignant, qui a été classée 2 selon les critères de terminologie commune pour les événements indésirables 4.0 (CTCAE 4.0), lorsque le deuxième cycle de l'immunothérapie CART a été rempli. Les éruptions ont été biopsiées avec illustration des changements pathologiques du lichen striatus tels que la perte d'une partie de l'épiderme, la dégénérescence vacuolaire des cellules basales et l'infiltration de nombreux lymphocytes T dans l'épiderme et ses appendices, et gérée avec succès avec de la pommade tacrolimus. Aucune hypotension n'a eu lieu pendant le traitement CART-EGFR. À l'exception de légères nausées, vomissements, frissons, fièvre et fatigue, il n'y a pas eu d'autres événements indésirables aigus au cours du traitement combiné. Bien que des pellicules soient apparues et se soient aggravées à la suite de l'immunothérapie combinée, elles n'ont pas nécessité d'interventions médicales. Les taux sériques de cytokines telles que le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α), l'IL-6 et la CRP ont légèrement augmenté et n'ont pas induit de symptômes de libération de cytokines. Pendant l'infusion de cellules CART133 à doses croissantes successives sur 4 jours, il n'y a eu aucun autre événement indésirable, à l'exception d'une légère fièvre et d'une fatigue liées à l'infusion. Cependant, le deuxième matin après l'achèvement de l'infusion de cellules CART133, cette patiente a développé une douleur diffuse dans la partie supérieure de l'abdomen, des frissons, de la fièvre (39,1 °C), des hémorragies sporadiques et des éruptions cutanées congestives sur ses mollets, qui se sont rapidement et différemment étendues à son cou, à son bras supérieur droit, à sa poitrine, à son abdomen gauche et à sa muqueuse rétropharyngée, accompagnées de prurit et de diarrhée dans l'après-midi et qui se sont détériorées davantage au cours des 10 jours suivants. Les événements indésirables cutanés et sous-cutanés ont été classés 3 selon le CTCAE 4.0. Des tests sériques de cytokines en série ont détecté une élévation rapide de TNF-α, IL-6 et CRP. L'éthanercept, une protéine de fusion qui agit comme inhibiteur du TNF, la méthylprednisolone intraveineuse et la gammaglobuline ont été administrés immédiatement et ont inversé avec succès les toxicités cutanées/muqueuses. L'utilisation de cellules T modifiées par CAR pour éradiquer les cancers a été étudiée pendant plus de 20 ans jusqu'à ce que, récemment, CART19 ait produit des résultats prometteurs dans les tumeurs malignes hématologiques exprimant CD19. Cependant, la manière de traduire ce succès excitant de la thérapie CART en tumeurs solides restait peu claire, nécessitant une meilleure compréhension des barrières thérapeutiques potentielles, y compris les facteurs qui régulent l'expansion des cellules CART, la persistance et le trafic in vivo, le microenvironnement tumoral et son interaction avec les cellules tumorales, et les cellules souches cancéreuses ainsi que les thérapies de conditionnement. Comme Porter et al. ont souligné que l'expansion vigoureuse et la persistance des cellules CART in vivo sont un déterminant critique de l'efficacité thérapeutique [], dans ce cas, le nombre de copies du transgène CAR dans le PB a atteint un niveau de pointe immédiatement après le début de l'infusion de cellules CART-EGFR, illustrant que les cellules CART-EGFR ont subi une expansion robuste in vivo, ce qui est l'une des prémisses des cellules CART-EGFR éliminant les cellules CCA exprimant EGFR. En outre, la persistance des cellules CART in vivo, malgré un certain nombre de facteurs d'interférence possibles tels que l'affinité du CAR pour la cible, l'immunogénicité du CAR et les facteurs dérivés de l'hôte, a été suggérée comme étant directement corrélée à un délai plus long de progression []. Ce patient a été traité avec la deuxième infusion de cycle de cellules CART-EGFR dès que le nombre de copies du transgène CAR dans le PB a chuté à un niveau proche du niveau de référence 8 semaines après la première infusion de cycle, permettant aux cellules CART de persister efficacement in vivo pendant plus de 24 semaines et au statut PR du patient d'être maintenu pendant 8,5 mois, ce qui peut suggérer que des infusions répétées de cellules CART pourraient contribuer à prolonger leur persistance in vivo et fournir une survie sans progression plus longue dans des conditions où la tumeur cible a répondu aux cellules CART-EGFR. En outre, nous avons également constaté que le nombre de copies du transgène CAR des cycles suivants d'infusion de cellules CART ne pouvait pas atteindre un pic parallèle ou supérieur, même en association avec l'anticorps anti-PD-1, par rapport à celui du premier cycle, indiquant un affaiblissement de l'expansion des cellules CART in vivo et une perte de cellules CART. Un mécanisme potentiel est que le scFv murin incorporé dans le transgène CAR peut conduire au développement d'une immunité des cellules T CD8+ [] La compétence fonctionnelle ultime des cellules CART dans les tumeurs solides est déterminée par la capacité de ces cellules à pénétrer efficacement dans le microenvironnement tumoral, un réseau complexe et dense de matrice fibrotique orchestré par les cellules malignes et non malignes, dans lequel les cellules CART infiltrées peuvent être inhibées par les cellules et molécules immunosuppressives telles que les Tregs, les cellules suppressives dérivées des myéloïdes (MDSC) et le ligand 1 de la protéine de mort cellulaire programmée (PD-L1) 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Lorsque la résistance à la thérapie CART-EGFR a été confirmée, nous avons une fois essayé une immunothérapie combinée par anticorps anti-PD-1 en association avec une perfusion de cellules CART-EGFR sur la base d'une étude préclinique selon laquelle le blocus de l'immunosuppression PD-1 pourrait améliorer significativement l'efficacité thérapeutique de la thérapie par cellules CART contre les tumeurs solides établies [] Malheureusement, ce traitement a échoué, la TEP-TDM ayant confirmé la progression de la maladie, bien que le CA199 ait diminué de manière transitoire. Une explication possible est le niveau peu clair de l'expression de PD-L1. Récemment, l'expression de PD-L1 est mise en évidence pour sa valeur dans la prédiction des effets thérapeutiques des médicaments anti-PD-1. Cependant, la lésion tumorale dans ce cas était difficile à biopsiée en raison de son emplacement anatomique, ce qui a fait que le niveau d'expression de la protéine PD-L1 sur les cellules tumorales ne pouvait pas être détecté avec précision avant l'initiation du traitement anti-PD-1, ce qui fait qu'il existe une possibilité que l'expression de PD-L1 dans le milieu tumoral soit faible ou même négative et entraîne donc l'échec du traitement anti-PD-1. Entre-temps, il existait de nombreuses autres voies de contrôle des points de contrôle parallèles qui pouvaient potentiellement soutenir la résistance à la thérapie anti-PD-1 [] Dans cette situation, la sélection d'une cible rationnelle était cruciale pour la prochaine étape du traitement des patients. Récemment, les CSC dans les CCA ont attiré une grande attention en raison de leurs propriétés hautement cancérigènes et de leurs rôles clés dans la médiation du renouvellement, de la ré-croissance et de la résistance thérapeutique des tumeurs, ce qui fait que le traitement qui cible les marqueurs moléculaires de surface et les voies de signalisation spécifiques aux CSC serait une option puissante possible pour les CCA [, ]. Parmi les molécules utilisées individuellement ou en association pour identifier les cellules souches du cholangiocarcinome, CD133 est l'un des marqueurs de cellules souches les plus importants associés à une invasion plus élevée et à un pronostic plus mauvais [] Shien et ses collègues ont également rapporté que les cellules tumorales CD133-positives présentaient une résistance plus élevée au traitement post-opératoire que les cellules CD133 négatives, et une augmentation de l'expression de CD133 a été observée dans les cellules cancéreuses résiduelles après une thérapie adjuvante [] Sur la base de ce qui précède, nous avons finalement sélectionné CD133 comme antigène cible pour l'immunothérapie CART, ce qui a produit une autre réponse partielle, et a démontré que l'immunothérapie par cocktail CART était faisable et rationnelle. Une autre question cruciale était la toxicité, qui pouvait être induite par les cellules CART sur les antigènes cibles exprimés sur les cellules tumorales et/ou simultanément sur les tissus normaux, ce que l'on appelle l'effet hors cible sur les tissus normaux. Les dommages aux tissus normaux pouvaient même se produire en raison d'une réaction croisée inattendue avec une protéine qui n'est pas exprimée sur les cellules tumorales []. Depuis le début de la perfusion de cellules CART-EGFR, cette patiente a présenté non seulement de la fièvre liée à la perfusion, des frissons et de la fatigue, mais également une pyrexie prolongée, une élévation aiguë des transaminases sériques et un début tardif d'éruptions cutanées, accompagnées d'une forte augmentation du nombre de copies du transgène CAR, de l'IL-6 et de la CRP, bien que ces taux ne répondent pas aux critères de diagnostic du syndrome de libération de cytokines [, ]. Les cytokines massives qui pouvaient être directement produites par les cellules CART perfusées reflétaient une forte réponse immunitaire qui pouvait engendrer à la fois des effets antitumoraux sur les cellules tumorales et des effets secondaires sur les tissus normaux. En outre, l'effet hors cible sur les tissus normaux provoqué par les cellules CART-EGFR était probablement la raison du déclenchement de toxicités cutanées dues à la distribution de l'EGFR sur l'épiderme []. Cependant, tous ces événements indésirables étaient modérés, réversibles et gérés avec des soins de soutien et des corticostéroïdes topiques. L'ajout d'un anticorps anti-PD-1 ne semblait pas aggraver les toxicités de l'immunothérapie CART-EGFR dans ce cas. Néanmoins, lors du traitement ultérieur par perfusion de cellules CART133, cette patiente a présenté des toxicités cutanées, orales et gastro-intestinales sévères, telles que des éruptions congestives et des hémorragies. Bien que ces toxicités aient été gérées avec succès par des interventions médicales d'urgence, y compris l'administration intraveineuse de méthylprednisolone et d'un inhibiteur anti-TNF, le mécanisme inhérent peut être largement dû à l'effet hors cible sur les tissus normaux des cellules CART133 qui ciblent l'antigène CD133 exprimé sur l'épithélium normal et l'endothélium vasculaire. En revanche, il n'était pas clair si les anticorps anti-PD-1 et les cellules CART-EGFR résiduelles in vivo pouvaient jouer un rôle dans la détérioration des toxicités de l'immunothérapie CART133.