La paciente es una niña de 11 años, nacida tres semanas antes de tiempo por cesárea debido a una posición transversal, con un peso al nacer de 2720 g. No hubo dificultades de alimentación en la lactancia ni después. El desarrollo motor y del lenguaje se retrasó: caminó sin apoyo a los 2 años y medio y a los 3 años dijo sus primeras palabras. A los 10 años ya conocía el alfabeto y trataba de unir las letras. Usó pañales hasta los 8-9 años. Su patrón de sueño es ligeramente irregular con despertares frecuentes. Nunca se detectaron malformaciones congénitas o epilepsia. Tiene una estatura normal con una longitud de acuerdo con el percentil 25-50 y un peso de acuerdo con el percentil 25, pero la circunferencia de su cabeza ha estado en el rango normal inferior (percentil 2.5-5). Sus rasgos faciales también son normales; no es claramente dismórfica. El comportamiento es normal sin rasgos autistas, pero el bruxismo es un problema. Prefiere la compañía de niños más pequeños. Su nivel intelectual se considera comparable a un retraso intelectual leve-moderado; aún no se han realizado pruebas de coeficiente intelectual formal. A los 9 años, la secuenciación del exoma completo (WES) reveló una variante de NAA10 (NM_003491.3) c.332 T > G p.V111G de novo, que se confirmó con la secuenciación de Sanger. En línea con otras variantes de NAA10 sin sentido, la sustitución V111G afecta a un aminoácido altamente conservado. NAA10 es una proteína de 235 aminoácidos que adapta el característico plegamiento GNAT común a las subunidades catalíticas NAT. Este plegamiento consiste en seis o siete cadenas β y cuatro hélices α. Las cadenas β 2-5 constituyen el núcleo de la proteína. Estas cuatro cadenas β, junto con la hélice α2 y el bucle β6-β7 importante para la unión al sustrato, están altamente conservadas. V111 está ubicado hacia el final de la cadena β5, y una valina en esta posición está altamente conservada en los homólogos de NAA10, así como en varias otras subunidades catalíticas NAT para las que se han resuelto las estructuras cristalinas, 4U9W (NAA40), 3FTY (NAA50), 5ICV (NAA60) y 4LX9 (ssNAT)) [–]. La cadena lateral de V111 está formando un bolsillo hidrófobo junto con Y145, M147, L119 y L109. También está en estrecha proximidad (3.7 Å) al grupo sulfuro de Acetil-CoA (AcCoA), lo que podría indicar un papel para V111 en la posición de AcCoA. Una glicina en esta posición no causará ningún conflicto estérico, pero la pérdida de la cadena lateral hidrófoba más voluminosa de valina puede causar alteraciones estructurales que afectan la estabilidad de la proteína o la unión a AcCoA. Para evaluar funcionalmente la NAA10-V111G, primero expresamos la His/MBP-NAA10-WT y la His/MBP-NAA10-V111G en E. coli, purificamos las enzimas y probamos la actividad NAT in vitro. A diferencia de la His/MBP-NAA10-WT, fue difícil obtener una buena expresión de la proteína de la His/MBP-NAA10-V111G, y una fracción sustancial de las moléculas purificadas de His/MBP-NAA10-V111G eluyó en el volumen vacío de la columna de cromatografía de exclusión por tamaño. Esto indica que partes de la proteína se agregan en unidades mayores a 200 kDa, lo más probable debido a una alteración de la estructura de la proteína, o a una estabilidad reducida de la proteína. Las enzimas que eluyeron en un volumen de columna correspondiente a la His/MBP-NAA10-V111G monomérica se probaron para determinar su actividad catalítica y se demostró que tenían una reducción de aproximadamente el 85% en la actividad catalítica en comparación con la His/MBP-NAA10-WT. Debido a los bajos niveles de expresión y al bajo rendimiento de la proteína de NAA10-V111G de E. coli transfectada y a la purificación de la proteína, se transfectaron células HeLa con plásmidos que codifican para NAA10-WT con V5 etiquetado o NAA10-V111G con V5 etiquetado, seguido de inmunoprecipitación (IP) de la proteína sobreexpresada con un anticuerpo anti-V5. Después de eso, se midió la actividad NAT en el precipitado. NAA10 y NAA15 forman un complejo de proteínas de alta afinidad, y, como se esperaba, la NAA15 endógena se co-inmunoprecipitó con la NAA10-WT-V5 sobreexpresada y la NAA10-V111G-V5. La cantidad de NAA10 y NAA15 presente en cada muestra se determinó mediante SDS-PAGE y transferencia Western. Las bandas de la transferencia Western se cuantificaron, y la actividad catalítica medida se correlacionó con la cantidad de NAA10-V5 presente en la muestra (es decir, una mezcla de NAA10 monomérico y NAA10 en complejo con NAA15, el complejo NatA), y se correlacionó por separado con la cantidad de NAA15 presente en la muestra (es decir, la cantidad del complejo NatA solamente). Los resultados del experimento de actividad IP se correlacionaron bien con nuestro hallazgo previo: la capacidad de NAA10-V111G para acetilar el N-terminal ácido EEEI24 se redujo en gran medida. Sin embargo, también reveló una segunda característica interesante: como se puede observar en la transferencia Western de la Fig., más NAA15 se co-inmunoprecipitó con NAA10-V111G-V5 en comparación con NAA10-WT-V5. Esto también se reflejó en nuestras mediciones de actividad NAT, donde la muestra de NAA10-V111G-V5 inmunoprecipitada mostró una mayor formación de producto NatA (para el sustrato polipeptídico NatA SESS24) en comparación con la muestra de NAA10-WT-V5 inmunoprecipitada cuando se correlacionó con la cantidad total de NAA10-V5 presente en la muestra. Sin embargo, cuando se correlacionó con la cantidad de NAA15 presente en cada muestra, la formación de producto NatA por NAA15 (y, por lo tanto, el complejo NatA) fue aproximadamente igual. Como el monómero NAA10 tiene una actividad NAT 1000 veces menor hacia los sustratos NatA en comparación con el complejo NatA [], la contribución del monómero NAA10 a la acetilación de SESS24 es mínima. En conjunto, esto sugiere que NAA10-V111G tiene una actividad catalítica reducida en forma monomérica, pero no en forma compleja con NAA15. Para evaluar el recambio de proteínas de NAA10-WT y NAA10-V111G, expresamos NAA10-V111G y NAA10-V111G en células HeLa y realizamos experimentos de persecución de cicloheximida. Como se puede observar en la figura, NAA10-V111G-V5 tiene un recambio más alto que NAA10-WT-V5. Dos horas después del tratamiento con cicloheximida, la cantidad promedio de NAA10-V111G-V5 se redujo en aproximadamente un 80 %, mientras que las moléculas de NAA10-WT-V5 se redujeron en un 20 % en relación con la cantidad de moléculas de NAA10 antes del tratamiento con cicloheximida. Aunque la cantidad de NAA10-V111G-V5 disminuye drásticamente después de dos horas, el nivel de NAA10-V111G-V5 parece estabilizarse en torno al 20 %. Lo más probable es que la sobreexpresión de NAA10-V111G-V5 esté presente tanto en una forma monomérica inestable que se degrada rápidamente como en complejo con NAA15, que estabiliza la enzima y la protege de la degradación.