Un hombre de 74 años de edad se presentó a su médico general en agosto de 2006 quejándose de pérdida de memoria y fue derivado al neurólogo. Mostró un rápido deterioro cognitivo global asociado con agresividad, comportamiento extraño y pérdida del lenguaje. Esto fue acompañado por una anomia severa, desinhibición y una puntuación de 10/30 en el MMSE. No hubo signos focales, mioclono o ataxia. El deterioro clínico fue muy rápido y en diciembre de 2006 se encontraba en un síndrome de tipo acinético-mutismo con posturas anormales. Dos imágenes de resonancia magnética (MRI) craneales, en octubre y diciembre de 2006, que incluían secuencias T1, T2, FLAIR y DWI, mostraron signos moderados de atrofia cerebral pero no un aumento de la señal anormal cortical o de los ganglios basales. El electroencefalograma (EEG) no fue diagnóstico y el nivel de proteína 14-3-3 en el líquido cefalorraquídeo (LCR) fue normal. El paciente falleció en marzo de 2007. La historia familiar de demencia incluía a un hermano de 80 años de edad diagnosticado con probable enfermedad de Alzheimer. No se encontraron mutaciones en el marco de lectura abierto tras secuenciar el gen de la proteína prión (PRNP). Se observó una metionina valina (MV) heterocigótica en el codón 129. Se observó un cambio espongiforme de moderado a leve en el neocórtex, el putamen/globus pallidus y el tálamo, con lesiones más evidentes en el putamen y el córtex frontal. No se encontraron vacuolas confluentes en ninguna región. Salvo unas pocas vacuolas focales en la capa molecular más profunda, el córtex cerebeloso no presentaba otras alteraciones. Las neuronas se conservaban en gran medida en el córtex cerebeloso y los ganglios basales, aunque rara vez se observaban vacuolas astrocíticas. Se observó una microgliosis leve a moderada en el córtex cerebeloso y los ganglios basales, y en la materia blanca subcortical, respectivamente. La tinción inmunológica de PrP sin pretratamiento con proteinasa K mostró una fuerte tinción caracterizada por finos depósitos puntiformes (similares a sinápticos) e irregulares granulares, a menudo confluentes, que podían catalogarse como sinápticos difusos. Los depósitos perineuronales y de placas cerebelares, las placas de kuru y las placas floridas estaban ausentes. Después del pretratamiento con PK, la gran mayoría de la tinción desapareció, excepto unos pocos depósitos granulares resistentes a PK de PrP. El cerebelo mostró un patrón sináptico discreto similar en las capas molecular y granular que desapareció después del pretratamiento con PK. La sensibilidad al pretratamiento con PK se visualizó mejor en secciones consecutivas con y sin pretratamiento con PK. Las secciones paralelas teñidas con el anticuerpo 3F4 mostraron una reducción marcada de la inmunorreactividad de PrP, según se evaluó mediante densitometría, que involucraba el 70-80% de la PrP total en las secciones de tejido. Esto se confirmó aún más al incubar las secciones de tejido con el anticuerpo 1E4 y comparar el patrón inmunohistoquímico de PrP de un caso de sCJD MV1 con el del probando. Como se muestra en la Figura, la inmunorreactividad de PrP sináptica 3F4 y 1E4 en el caso común MV1 mostró una inmunorreactividad de PrP resistente. En contraste, la inmunorreactividad de 3F4 y 1E4 se eliminó prácticamente después del pretratamiento con PK en el probando. Además de estos cambios, se observaron ovillos neurofibrilares y preovillos, así como gránulos (granos), en las cortezas entorrinal y perirrinal, el subículo y las regiones CA1 y CA3 del hipocampo. También se observaron algunos preovillos y granos en la amígdala. Estos cambios estuvieron acompañados por algunos depósitos de tau hiperfosforilados en las neuronas del giro dentado, los cuerpos helicoidales en la materia blanca del lóbulo temporal y los astrocitos peri-ventriculares. En la corteza entorrinal y la amígdala se observaron neuronas con forma de globo inmunorreactivas a la alfa-cristalina. La patología tau fue coherente con la enfermedad de Alzheimer en estadio III y la enfermedad de los granos argirófilos en estadio 3. Las placas amiloides y las inclusiones de alfa-sinucleína estuvieron ausentes. No se encontraron anomalías con los anticuerpos anti-TDP-43. El procedimiento estándar de transferencia Western de PrP (10% de homogenato de cerebro y concentración final de PK de 440 µg/ml) no logró detectar PrPSc. El aumento del volumen cargado en el gel de 5 a 10 µl produjo una señal extremadamente débil correspondiente a 24 y 19 kDa bajo tiempos de exposición de película de saturación. La disminución de las concentraciones de PK (440, 100 y 50 µg/ml) mostró un aumento en la señal de PrPSc, lo que sugiere una proteína priónica PK-sensible. Incluso entonces, solo dos bandas de 24 y 19 kDa eran visibles. Después de aumentar el porcentaje de homogenato de cerebro a 20%, se obtuvo el mismo patrón de dos bandas. Usando el kit TeSeE®, caracterizado por condiciones de digestión PK más suaves, seguidas por etapas de purificación y concentración de la proteína y tinción con Sha31 Mab, se reveló la presencia de dos bandas inesperadas de 21 y 16 kDa. Este perfil de banda se observó en todas las regiones cerebrales y constituyó un resultado sorprendente, ya que su peso molecular era diferente del detectado previamente con Mab 3F4 y 6H4. Realizar una combinación de digestión, purificación y concentración de la muestra según las recomendaciones del kit TeSeE®, junto con la detección usando 3F4 y 6H4, produjo un nuevo patrón. No solo las bandas anteriores de 24, 21, 19 y 16 kDa estaban presentes en cada una de las muestras, sino que también se observó una banda muy débil de 28 kDa y un fragmento de aproximadamente 6kDa en algunas regiones cerebrales. Además, se obtuvieron diferencias de intensidad de señal con los anticuerpos 3F4 y 6H4, lo que sugiere una afinidad diferencial por PrPSc que podría interpretarse como una conformación proteica diferente en la que el epítopo de unión a 3F4 estaba más expuesto que el de 6H4. El análisis de desglicosilación reveló tres isoformas desglicosiladas de 19, 16 y 6 kDa, que eran más intensas en la corteza (parietal, frontal y temporal) y más débiles en la corteza occipital y el putamen/globus pallidus. En la región del tálamo, se detectaron dos bandas, una más intensa de 19 kDa y una más débil de 16 kDa. Finalmente, el cerebelo fue la única región donde se observó una única banda desglicosilada de 19 kDa, similar a la encontrada en la ECJv tipo 2. Sin embargo, no podemos descartar la posibilidad de que este hallazgo fuera el resultado de la presencia de una pequeña cantidad de PrPSc y una subrepresentación de las otras bandas, como se observó en el tálamo, donde una banda de tamaño de 16 kDa se observó solo bajo tiempos de exposición de película más largos. La evaluación de la sensibilidad a la digestión PK se logró midiendo la absorbancia de PrPSc antes y después del tratamiento con proteinasa K utilizando la prueba IDEXX HerdChek BSE. Esta tecnología se basa en la captura selectiva de PrPSc por un polímero químico específico a través de interacciones poliónicas en presencia de PrPC de una muestra de homogeneizado de cerebro. Los valores de absorbancia disminuyen con las diluciones en serie, por lo que puede asumirse que la cantidad de PrPSc es directamente proporcional a la absorbancia. El objetivo de este protocolo fue realizar una cuantificación relativa de PrPSc sin tratamiento con proteasas. Consideramos que la introducción de una etapa de digestión podría ser útil para evaluar fácilmente la resistencia relativa a la digestión PK. Los resultados mostraron que los valores de absorbancia disminuyeron después del tratamiento PK en todas las muestras (Tabla). Para la encefalopatía multi-infarto (MIE) y la sCJD VV2, la detección de la señal se redujo en un 4,32% y un 2,02%, respectivamente, pero las reducciones no fueron estadísticamente significativas. Por el contrario, las muestras de proband y sCJD MM1 mostraron una reducción estadísticamente significativa (p < 0,005) de la señal en un 79,82% y un 22,68%, respectivamente. Los valores de absorbancia para MIE estuvieron por debajo del límite, al mismo nivel que los controles negativos. Los valores restantes estuvieron por encima del límite. Estos niveles diferenciados de reducción de señal son indicativos de tres niveles de resistencia a la digestión por PK: alto, intermedio y bajo. Una alta resistencia a la digestión por PK se representaría por un bajo porcentaje de reducción de señal, como se observó para sCJD VV2. En este caso, la reducción de 2% en la señal indicaría que la digestión por PK solo degradaría una fracción mínima de PrPSc, lo que sugeriría una alta resistencia de la proteína priónica anormal. La resistencia intermedia se representaría por un porcentaje ligeramente superior de reducción de señal, como se observó en sCJD MM1, en el que 22% indicaría una fracción degradable de PrPSc superior a la observada en el caso anterior. Esto representaría un tipo de proteína solo ligeramente sensible a la degradación con proteasas, dependiendo de la región del cerebro. Se están llevando a cabo más investigaciones para dilucidar si este nivel de degradación está asociado con el tipo de proteína MM1 o con un fenómeno específico de este sujeto. Finalmente, la baja resistencia a la digestión por PK se representaría por un alto porcentaje de reducción de señal, por ejemplo, el 79% observado en el probando, lo que indicaría que una fracción alta de PrPSc es degradable. Esto sugiere la existencia de tipos de proteínas priónicas anormales extremadamente susceptibles a la digestión por proteasas que podrían pasarse por alto potencialmente por métodos de detección basados en la resistencia a la proteinasa característica de la proteína priónica patológica.