Una nutria eurasiática macho de 4 años de edad nacida en 2015 en el «Sendaviva, Natural Park of Navarra» (42°11′31″N, 1°09′54″O) (noreste de España) fue trasladada al parque de vida silvestre «Terra Natura» (sureste de España) en 2017. El parque de vida silvestre «Terra Natura» está ubicado en las afueras de la ciudad de Murcia (38°00′40″N, 1°09′54″O). El recinto para nutrias consistía en un área con refugios de acceso libre y un estanque que contenía 4 animales de esta especie (2 machos y 2 hembras). No se aplicó insecticida para moscas de arena en las nutrias. En agosto de 2019, el animal presentó epistaxis bilateral, anorexia, apatía y pérdida de peso. El animal fue sedado antes de la manipulación con medetomidina (0,2 mg/kg/i.m.) y ketamina (20 mg/kg/i.m.). Se extrajo sangre completa por punción venosa de la vena cefálica, se drenó en un tubo de 1 ml recubierto con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y un tubo de 1 ml sin anticoagulante para un recuento completo de células sanguíneas (CBC) y análisis bioquímicos, respectivamente. El CBC se realizó en un contador de células sanguíneas (ADVIA 120 Hematology System, Siemens, Italia), y los análisis bioquímicos se realizaron en un analizador bioquímico automático (Olympus AU600 Automatic Chemistry Analyzer, Olympus Europe GmbH, Hamborg, Alemania). Además, se tomó orina por cistocentesis guiada por ultrasonido para análisis de orina. Se realizó un estudio ecográfico del corazón y los órganos abdominales, incluidos los riñones, el bazo, el hígado, la vesícula biliar, el páncreas y el sistema digestivo. Como los resultados bioquímicos y ecográficos eran compatibles con la leishmaniosis clínica, se realizaron pruebas serológicas y moleculares para confirmar la presencia de la infección. La presencia de anticuerpos IgG2 anti-Leishmania se evaluó en el suero de la nutria mediante un ensayo inmunofluorométrico resuelto en el tiempo (TR-IFMA) realizado como se describe por Cantos-Barreda et al. []. Para probar que el ensayo TR-IFMA validado para suero de perro puede aplicarse al suero de nutria, se realizó un análisis Western blot. El Western blot se realizó en sueros de nutria con signos compatibles con leishmaniosis y de un perro seropositivo para Leishmania mediante TR-IFMA. Los sueros (dilución 1:2000) se separaron en condiciones reductoras en mini geles de poliacrilamida (0,1% de dodecil sulfato de sodio (SDS), 12% de gel de resolución y 4% de gel apilador). Las proteínas resueltas se transfirieron electroforéticamente a una lámina de nitrocelulosa (Bio-Rad, EE. UU.) y se colocaron en un sustrato ROTI®Lumin (Carl Roth, Alemania) para bloquear durante 2 h a temperatura ambiente. El anticuerpo policlonal anti-IgG2 de perro (AHP498; Bio-Rad, EE. UU.) a una dilución de 1:1000 se usó como anticuerpo primario, mientras que el anticuerpo anti-IgG2 de oveja conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (SAB3700702; Sigma-Aldrich, EE. UU.) a una dilución de 1:1000 se usó como anticuerpo secundario para detectar el anticuerpo primario unido. La detección de la señal se realizó utilizando un kit Pierce ECL2 (Pierce, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) y se digitalizó en el escáner Typhoon 9410 (GE Healthcare, EE. UU.). Se observó una banda de aproximadamente 150 kDa en la muestra de nutria, así como en la muestra de perro (ver figura y archivo adicional). Estos hallazgos corroboraron que el ensayo TR-IFMA que utiliza anticuerpo policlonal anti-IgG2 de perro fue capaz de detectar la IgG2 de la nutria. El ensayo TR-IFMA consistió en un método indirecto no competitivo basado en antígeno recombinante biotinilado K39 como reactivo de captura, y anticuerpo policlonal anti-IgG2 de perro (anticuerpo anti-IgG2 de oveja, Bio-Rad, EE. UU.) Eu3 +-etiquetado como detector. La prueba incluyó suero de un perro seropositivo para Leishmania como control positivo, y suero de un perro seronegativo para Leishmania como control negativo. El análisis se realizó en un contador de múltiples marcadores (VICTOR2 1420, PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Turku, Finlandia). Los resultados se expresaron como unidades de fluorometría para Leishmania (UFL). El límite se estableció en 22 UFL. También se realizó un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) (Leiscan® Leishmania ELISA Test, Esteve Veterinaria, Laboratorios Dr. Esteve SA, Barcelona, España) para detectar anticuerpos IgG específicos contra Leishmania spp. Se diluyeron las muestras de suero 1:20 y los resultados se expresaron como relación muestra/positivo (S/P), calculada por densidad óptica (DO) muestra/DO bajo control positivo. Los valores de S/P por encima de 1,1 se consideraron positivos. La presencia de ADN de Leishmania spp. en sangre completa y médula ósea se evaluó mediante amplificación de la secuencia de ADN de kinetoplasto de Leishmania spp. utilizando una rtPCR con cebadores y sondas previamente descritos []. La médula ósea se extrajo mediante aspiración con aguja fina de la unión costocondral y se drenó en un tubo de 1 ml recubierto con EDTA. El ADN se extrajo utilizando el kit de preparación de plantilla de PCR High Pure (Roche, Alemania), siguiendo las instrucciones del fabricante. La rtPCR se realizó en un volumen final de 20 ul, que incluía 1× TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents (VIC Probe) (Exo IPC) (Applied Biosystems, CA, EE. UU.) y 50 ng de ADN de cada muestra. La rtPCR se realizó en un volumen final de 20 ul, que incluía 1× TaqMan Universal Probe Supermix (Bio-Rad, CA, EE. UU.), 900 nM de cada cebador, 200 nM de sonda TaqMan, 1× Exo IPC Mix, 1× Exo IPC DNA y 50 ng de ADN de cada muestra. Los parámetros de ciclado fueron: 50 °C durante 30 s, 95 °C durante 10 min, 45 ciclos a 94 °C durante 30 s y 55 °C durante 1 min. Cada ciclo de amplificación incluía controles positivos y negativos, y cada medición se realizó por triplicado. Para la identificación de especies de Leishmania, los productos de PCR de las muestras positivas se purificaron utilizando el kit de purificación de productos de PCR High Pure (Roche, Alemania) y se enviaron para secuenciación a la Sección de Biología Molecular de la Universidad de Murcia. Las secuencias obtenidas se compararon con las disponibles en GenBank. Además, como control negativo, se realizaron los mismos análisis en una nutria eurasiática hembra de 3 años del mismo parque natural que no presentaba signos clínicos compatibles con la leishmaniosis. Todos los resultados aparecen en la Tabla. Se confirmó la presencia de leishmaniosis y se administró un tratamiento específico (allopurinol 15 mg/kg/24 h/p.o.). En noviembre de 2019, después de 3 meses de tratamiento, se realizó un seguimiento del tratamiento. Se observaron una nefropatía bilateral con hidronefrosis, una linfadenomegalia mesentérica y una ascitis. El hemograma reveló una disminución de los glóbulos blancos y una disminución de las plaquetas en la nutria positiva para Leishmania. El perfil bioquímico sérico de la nutria positiva para Leishmania mostró una hiperproteinemia, una hiperglobulinemia, una disminución de PON-1 y un aumento de haptoglobina y ferritina. El análisis de orina reveló proteinuria y una disminución de la osmolaridad y la gravedad específica. Se observó la presencia de anticuerpos IgG2 anti-Leishmania y un resultado positivo por RT-PCR en términos de sangre total y médula ósea para la nutria positiva para Leishmania. La secuenciación de las muestras positivas confirmó la identificación de L. infantum. La secuencia amplificada mostró una similitud del 100 % con una secuencia de referencia de L. infantum. Además, se observaron microorganismos ovales con un núcleo excéntrico compatible con amastigotos de Leishmania spp. en la citología del bazo (Fig.