Una mujer de 52 años de edad con antecedentes de colecistectomía y resección parcial del lóbulo hepático izquierdo en 2004 debido a cálculos biliares sintomáticos y múltiples metástasis intrahepáticas del conducto biliar, tuvo fiebre intermitente y progresiva ictericia desde principios de noviembre de 2014. La obstrucción del conducto biliar y la sospecha de una neoplasia hepática en el hilio se detectaron mediante ultrasonografía, resonancia magnética de colangiopancreatografía (RMCP), resonancia magnética, y tomografía por emisión de positrones-tomografía computarizada (PET-TC). Se realizó una laparotomía exploratoria a fines de noviembre de 2014 (Archivo adicional: Figura S1) y se encontró una adhesión intraabdominal severa, un bulto (1 × 2 cm) con textura endurecida en el conducto hepático izquierdo proximal, y metástasis neoplásicas diseminadas que infiltran el hilio del conducto hepático común, el ligamento hepatoduodenal, los ganglios linfáticos circundantes, la arteria hepática, la vena porta y el eje celíaco. Estos hallazgos obligaron a los cirujanos a renunciar a la resección radical. Se descargó bilis purulenta del conducto común y un tapón de moco sobresalía de la pared del conducto biliar. Se extirparon lesiones neoplásicas parciales de los ganglios linfáticos agrandados, el lóbulo izquierdo del conducto hepático y el margen del conducto hepático común para el examen patológico. Se instaló un drenaje del conducto T para aliviar la obstrucción biliar. Los informes patológicos revelaron que la naturaleza del tumor era un adenocarcinoma pobremente diferenciado con marcadores de diferenciación de colangiocitos; además, se detectó una expresión moderada de EGFR en >90% de las células tumorales. Finalmente, se diagnosticó a la paciente como CCA perihilar avanzado no resecable. Cinco semanas después de la cirugía paliativa, la paciente recibió un ciclo de 4 semanas de terapia con TOMO en la neoplasia maligna hilar (DT = 60 Gy/25 F), un ciclo de quimioterapia sistémica con paclitaxel unido a albúmina solo para sus intolerables toxicidades gastrointestinales y la infusión de células asesinas inducidas por citoquinas autólogas. Debido al aumento progresivo de CA199, se volvió a examinar inmediatamente después de la finalización de la radioterapia y mostró una nueva lesión hipermetabólica metastásica en el lóbulo caudado hepático y un agrandamiento de los tejidos blandos y metástasis linfáticas retroperitoneales con un valor de captación estándar anormal (SUV) entre el hígado y el estómago en comparación con la PET-TC previa a la radioterapia. Cuatro semanas después de la radioterapia, la paciente se inscribió en el ensayo CART-EGFR. Su estado de rendimiento fue de 1 según los criterios del Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG). Durante la preparación de las células CART-EGFR, desarrolló fiebre alta, ictericia agresiva y obstrucción del tracto biliar, acompañada por la elevación continua de CA199 (de 100,5 a 413,5 U/ml), aumento agresivo de la bilirrubina total, bilirrubina directa y otros índices de obstrucción biliar relacionados con la enzima, y se trató con antibióticos de amplio espectro eficaces y colocación de stent biliar endoscópico en los conductos biliares hepáticos. Los ensayos (identificador de ClinicalTrials.gov NCT01869166, NCT02541370) fueron aprobados por la junta de revisión institucional del Hospital General del EPL chino. No hubo ningún patrocinador comercial involucrado en los estudios. Los pacientes inscritos dieron su consentimiento informado por escrito de acuerdo con la Declaración de Helsinki. La secuencia de ADN del fragmento de cadena única variable (scFv) que se dirige al antígeno EGFR se derivó de JQ306330.1 (número GenBank). Se generó y se clonó en el esqueleto lentiviral pWPT el CAR scFv-CD137-CD3zeta, que se describió en detalle por Feng et al. []. La construcción se verificó mediante secuenciación de ADN. Se produjo un sobrenadante de vector lentiviral pseudotipado de grado clínico mediante transfección transitoria estándar, como describió McGinley et al. [ ] De acuerdo con las instrucciones del fabricante del reactivo de transfección Lipofectamine 3000 (Invitrogen, EE. UU.), se transfectaron el plásmido pWPT-anti-EGFR CAR, el plásmido de empaquetado ps-PAX2 y el plásmido de envoltura pMD2.G en células 293 T. Los sobrenadantes lentivirales se recolectaron y se almacenaron a −80 °C. Se construyó el vector GFP-CD137-CD3zeta para verificar la eficiencia de la transducción mediante citometría de flujo FACSCalibur (BD Biosciences). La secuencia de ADN del scFv que se dirige al antígeno CD133 se derivó de HW350341.1 (número GenBank), la generación, construcción y prueba de las células CART-EGFR siguió el mismo procedimiento que las células CART-EGFR (archivo adicional: Figura S2). Las células CART se fabricaron a partir de células mononucleares de sangre periférica autólogas (PBMC) recogidas en tubos de preparación de células (BD Biosciences, San Jose, CA) purificadas a partir de 80 a 100 ml de sangre completa en la Instalación de Buenas Prácticas de Fabricación del Hospital General del PLA chino de acuerdo con los procedimientos operativos estándar actuales. Las PBMC se estimularon con 50 ng/ml de anti-CD3 MoAb (Takara, Japón) y 500 U/ml de interleucina-2 humana recombinante (Peprotech, EE. UU.) en medio GT-T551 (Takara). La transducción lentiviral se realizó en medio GT-T551 con sulfato de protamina (Sigma) durante 24 h después de 2 días de cultivo de células T. Después, las células se expandieron aún más en bolsas de cultivo (Takara) y se cosecharon como células CART. Se analizaron bacterias, hongos y endotoxinas antes de la infusión de células CART. El inmunofenotipo de las células CART se analizó mediante citometría de flujo con anticuerpos marcados con fluorescencia específicos para la tinción de CD3, CD4, CD8, CD45RO, CD62L y CCR7. Se usaron anticuerpos monoclonales de isotipo coincidente (BD Biosciences) para la tinción de control. La expresión de CAR se estimó en base a las células transducidas con GFP-CD137-CD3zeta en el mismo lote para todos los pacientes mediante citometría de flujo. La adquisición y el análisis de datos se realizaron mediante una citometría de flujo FACSCalibur (BD Biosciences). La citotoxicidad in vitro de las células CART-EGFR se probó mediante el cultivo conjunto con células tumorales positivas para EGFR en varias relaciones efector-objetivo en placas de 96 pocillos utilizando un kit de detección CCK-8 de 4 h (DOJINDO, Japón). Se empleó la PCR cuantitativa en tiempo real (Q-PCR) para evaluar el nivel del gen de fusión CAR de acuerdo con un protocolo previamente descrito.13 Se amplificó un fragmento de 153 pb (pares de bases) que contiene porciones de la cadena CD8a y la cadena 4-1BB adyacente (el cebador directo 5′-GGTCCTTCTCCTGTCACTGGTT-3′ y el cebador inverso 5′-TCTTCTTCTTCTGGAAATCGGCAG-3′) mediante el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems). Se usó beta-actina como control interno. Se preparó una curva estándar de 7 puntos que consistía en ADN plasmídico de 100 a 108 copias/ul que contenía el gen CAR. Se analizaron los niveles séricos de IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-12/IL23p40, IFN-γ, TNF-α, VEGF y granzima B mediante un inmunoensayo sándwich de microesferas BD Biosciences, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. De acuerdo con el sistema de cultivo descrito anteriormente [], se generaron células CART-EGFR a partir de las células mononucleares de 80-100 ml de sangre periférica del paciente y se liberaron para las infusiones. De las células infundidas durante el primer ciclo de terapia CART-EGFR, el 99,14 % eran células CD3+, compuestas principalmente por el subconjunto CD8+ (62,26 %), y el 23,61 % se caracterizaron con el fenotipo de memoria central (CD45RO+/CD62L+/CCR7+). Además, el 8,99 % de las células infundidas eran positivas para EGFR. El fenotipo y la eficiencia de transfección de las células CART-EGFR infundidas en cada ciclo se documentan en la Tabla. Se generaron células CART133 y se cultivaron de acuerdo con el mismo procedimiento que las células CART-EGFR. De las células infundidas, el 95,2% eran células CD3+ compuestas principalmente por el subconjunto CD8+ (71,9%), y el 41,9% eran células del subconjunto CD45RO+/CD62L+/CCR7+. Además, el 6,4% de las células infundidas eran positivas para CD133. Los detalles se documentan en la Tabla. Debido a la radioterapia completada recientemente en un plazo de 2 meses y la intolerancia a los agentes quimioterapéuticos, se administró a la paciente infusiones sucesivas de 4 días de 2,2 × 106/kg de células CART-EGFR en total sin ninguna terapia de acondicionamiento, y logró una respuesta positiva en su primera evaluación 6 semanas después, evaluada de acuerdo con los criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos versión 1.1 (RECIST 1.1) con MRI y PET-CT, que ilustraron una reducción de más del 80 % de las lesiones metastásicas en la región hepática hilar y el lóbulo caudado y una notable disminución de SUV, junto con una rápida reducción de CA199 de 413,5 a 123,1 U/ml. El número de copias del transgén CAR en la sangre periférica de la paciente alcanzó un máximo de 5916 pg/dl en el día 9, acompañado con la liberación de citoquinas tales como interleucina-6 (IL-6) y proteína reactiva C (CRP). El segundo ciclo de monoterapia CART-EGFR se administró con una dosis de células T que expresan EGFR-CAR+ de 2,1 × 106/kg y sin ningún tratamiento previo de acondicionamiento, debido a que el número de copias del transgén CAR en la sangre periférica disminuyó cerca del nivel inicial 2 meses después de la primera infusión de células T genéticamente modificadas que expresan CART-EGFR. Los exámenes de rutina de MRI y PET-CT mostraron un PR persistente acompañado con una reducción adicional de CA199 a 61,2 U/ml. Es interesante destacar que el pico del número de copias del transgén CAR después de la infusión del segundo ciclo de células CART-EGFR no alcanzó un nivel paralelo o superior al del primer ciclo de terapia CART-EGFR. El estado de PR de la paciente se mantuvo durante 8,5 meses hasta que desarrolló vómitos incontrolados frecuentes, dolor sordo en la región abdominal superior y reflujo gástrico, que ocurrieron a mediados de noviembre de 2015. La posterior gastroscopia electrónica mostró estenosis del bulbo duodenal y el PET-CT confirmó la progresión del tumor con la ilustración de múltiples nuevas lesiones anormales SUV en el omento mayor, el peritoneo y la cavidad abdominal. Posteriormente, el paciente fue tratado con 1 ciclo de terapia CART-EGFR combinado con 2 ciclos de anticuerpo monoclonal anti-proteína 1 de muerte celular programada (PD-1) (Nivolumab, Bristol-Myers Squibb), que se administró a una dosis de 100 mg cada 2 semanas. Asimismo, el número de copias del transgén CAR monitorizado en sangre periférica no alcanzó un nivel máximo similar al de la infusión del primer ciclo, incluso combinado con anticuerpo anti-PD-1. A pesar de que el CA199 en suero disminuyó de forma transitoria de 326,3 a 210,8 U/ml, el siguiente PET-CT detectó nuevas metástasis emergentes en el fondo de la pelvis, el lóbulo hepático derecho y el ganglio linfático supraclavicular izquierdo, así como el agrandamiento de las lesiones tumorales anteriores en el abdomen, en comparación con el PET-CT antes de la inmunoterapia combinada. Debido a que más del 90% de las células tumorales expresaban la proteína CD133 (archivo adicional: Figura S3), la paciente se enroló en el estudio CART133 y recibió la infusión de 1,22 × 106/kg de células CART específicas de CD133 sin tratamiento de acondicionamiento. Debido a la obstrucción en el duodeno descendente y la infección persistente grave de las vías biliares, así como el absceso hepático, que pueden interferir con el nivel de CA199 en suero y se trataron con antibióticos, la evaluación de imágenes programada se pospuso hasta 2 meses después de la infusión de células CART133, en la que la TC realzada con contraste mostró una notable contracción o incluso desaparición de algunas metástasis en el peritoneo y la cavidad abdominal, lo que llevó a una evaluación de PR y hemocultivos, que no apoyaron el diagnóstico de infección, pero mientras tanto, la escalada de IL-6 y CRP y el aumento agudo de glutamato-pirúvico transaminasa y glutamato-oxalacetato transaminasa (>6ULN). Aparecieron unos pocos sarpullidos dispersos en el muslo izquierdo 2 semanas después de la infusión del primer ciclo de células CART-EGFR, que gradualmente empeoraron y se hicieron evidentes y pruriginosos con la presentación de múltiples sarpullidos escamosos o lineales que se extendían desde el muslo izquierdo hasta la pantorrilla y se unían, que se clasificó 2 según los criterios de terminología común para eventos adversos 4.0 (CTCAE 4.0), cuando se completó el segundo ciclo de inmunoterapia CART. Los sarpullidos se biopsiaron con ilustración de cambios patológicos similares al liquen estriado, como la pérdida de epidermis parcial, degeneración vacuolar de células basales e infiltración de numerosos linfocitos T en la epidermis y sus apéndices, y se manejaron con éxito con ungüento de tacrolimus. No se produjo hipotensión durante el tratamiento CART-EGFR. Excepto por náuseas leves, vómitos, escalofríos, fiebre y fatiga, no se produjeron otros eventos adversos agudos en el transcurso del tratamiento combinado. Aunque apareció caspa y empeoró tras la inmunoterapia combinada, no fue necesario realizar intervenciones médicas. Los niveles séricos de citoquinas tales como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), IL-6 y CRP se elevaron ligeramente y no indujeron ningún síntoma de liberación de citoquinas. Durante la infusión de sucesivas dosis de CART133 en aumento durante 4 días, no hubo otros eventos adversos, excepto fiebre leve y fatiga relacionados con la infusión. Sin embargo, en la segunda mañana después de la finalización de la infusión de células CART133, esta paciente desarrolló dolor abdominal superior sordo intermitente, escalofríos, fiebre (39.1 °C), hemorragias esporádicas y erupciones congestivas en sus pantorrillas, que se extendieron rápidamente y de forma difusa a su cuello, brazo superior derecho, pecho, abdomen izquierdo y mucosa retrofaríngea, acompañados de prurito y diarrea esa tarde y que se deterioraron aún más en los siguientes 10 días y ligando 1 de la proteína de muerte celular programada (PD-L1) [,], lo que da lugar a una rápida pérdida de su capacidad de secreción de citocinas y citolítica y a la entrada en un estado de hiposensibilidad []. Además, los tumores sólidos frecuentemente demuestran aberraciones metabólicas al consumir en exceso aminoácidos clave críticos para la actividad de las células T e inducen hipoxia y una acidificación resultante de la matriz extracelular debido a un suministro vascular insuficiente que es hostil para la supervivencia de las células T [] Por lo tanto, la modulación del microambiente tumoral es necesaria para mejorar los resultados. En este caso, a pesar de que la paciente no recibió ningún tratamiento directo de acondicionamiento con el fin de transformar el microambiente tumoral, se la trató con 60 Gy de radioterapia antes de la inmunoterapia con un intervalo de aproximadamente 1 mes desde el final de la radioterapia hasta el comienzo de la infusión de células CART. Aunque la radioterapia en sí misma no logró erradicar de manera efectiva las células tumorales, su efecto directo y retardado puede desempeñar un papel en la destrucción del estroma de soporte del tumor, alterando la biología del microambiente tumoral, promoviendo la liberación de más antígenos asociados al tumor y mejorando el reconocimiento inmunitario [] Además, la radioterapia podría hacer que los tumores sean más inmunogénicos y más susceptibles a un ataque mejorado por las células inmunes [], e incluso generar efectos antitumorales en aquellas metástasis distantes que no fueron irradiadas localmente (conocido como efecto abscopal) [, ]. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la radioterapia podría ser una terapia de acondicionamiento razonable y efectiva para mejorar el resultado de la terapia CART. Cuando se confirmó la resistencia a la terapia CART-EGFR, una vez probamos una combinación de inmunoterapia con anticuerpo anti-PD-1 junto con infusión de células CART-EGFR en base a un estudio preclínico que demostró que el bloqueo de la inmunosupresión PD-1 podría mejorar significativamente la eficacia terapéutica de la terapia con células CART contra tumores sólidos establecidos []. Desafortunadamente, este tratamiento terminó en fracaso con un PET-CT que verificó la progresión de la enfermedad, aunque CA199 disminuyó de manera transitoria. Una posible explicación es el nivel poco claro de expresión de PD-L1. Recientemente, la expresión de PD-L1 se destaca por su valor en la predicción de los efectos terapéuticos de los fármacos anti-PD-1. Sin embargo, la lesión tumoral en este caso fue difícil de biopsiar debido a su ubicación anatómica, lo que resultó en que el nivel de expresión de la proteína PD-L1 en las células tumorales no pudo detectarse con precisión antes del inicio de la terapia anti-PD-1, lo que existe la posibilidad de que la expresión de PD-L1 en el medio tumoral sea de bajo nivel o incluso negativa y, por lo tanto, conduzca al fracaso del tratamiento anti-PD-1. Mientras tanto, hubo muchas otras vías de control de puntos de verificación paralelas que podrían apoyar la resistencia a la terapia anti-PD-1 [] En esta situación, la selección de un objetivo racional fue crucial para el siguiente paso del tratamiento de los pacientes. Recientemente, las CSC en CCA han atraído gran atención por sus propiedades altamente carcinogénicas y sus funciones clave en la mediación de la autorrenovación, el rebrote del tumor y la resistencia terapéutica, por lo que la terapia dirigida a marcadores moleculares de superficie y vías de señalización específicas para CSC sería una opción potente para CCA [,] Entre las moléculas utilizadas individualmente o en combinación para identificar marcadores de células madre de colangiocarcinoma, CD133 es uno de los marcadores de células madre más importantes que están asociados con una mayor invasividad y un peor pronóstico [] Shien y sus colegas también informaron que las células tumorales CD133 positivas mostraron una mayor resistencia al tratamiento postoperatorio que las células CD133 negativas, y se observó una mayor expresión de CD133 en las células cancerosas residuales después de la terapia adyuvante [] En base a lo anterior, finalmente seleccionamos CD133 como el antígeno objetivo para la inmunoterapia CART, que a su vez produjo otra respuesta parcial, y demostró además que la inmunoterapia CART podría ser factible y racional. Otra cuestión de gran preocupación fue la toxicidad, que podría ser inducida por las células CART en los antígenos diana expresados en las células tumorales y/o de forma sincrónica en los tejidos normales, denominados efecto diana fuera del tumor. El daño a los tejidos normales puede ocurrir incluso por una reacción cruzada inesperada con una proteína que no se expresa en las células tumorales []. Desde el inicio de la infusión de células CART-EGFR, este paciente experimentó no solo fiebre, escalofríos y fatiga relacionados con la infusión, sino también pirexia sostenida, elevación aguda de las transaminasas séricas y aparición tardía de erupciones cutáneas, acompañadas por una elevación robusta del número de copias del transgén CAR, IL-6 y CRP, aunque los niveles de los mismos no cumplían los criterios para diagnosticar el síndrome de liberación de citoquinas [, ]. Las citoquinas masivas que podrían ser producidas directamente por las células CART infundidas reflejaban una fuerte respuesta inmunitaria que podría generar efectos antitumorales en las células tumorales y efectos secundarios en los tejidos normales. Además, el efecto diana fuera del tumor causado por las células CART-EGFR fue probablemente la razón para la aparición de toxicidades dérmicas debido a la distribución de EGFR en la epidermis []. No obstante, todos estos eventos adversos fueron leves, reversibles y se manejaron con cuidados de apoyo y corticosteroides tópicos. La adición de anticuerpo anti-PD-1 no agravó aparentemente las toxicidades de la inmunoterapia CART-EGFR en este caso. No obstante, en el tratamiento posterior de la infusión de células CART133, este paciente sufrió toxicidades dérmicas, orales, mucosas y gastrointestinales graves, tales como erupción congestiva y hemorragia. Aunque estas toxicidades se manejaron con éxito mediante intervenciones médicas emergentes, incluida la metilprednisolona intravenosa y el inhibidor anti-TNF, el mecanismo inherente puede deberse en gran medida al efecto diana fuera del tumor de las células CART133 que se dirigieron al antígeno CD133 expresado en el epitelio normal y el endotelio vascular. Mientras tanto, no estaba claro si el anticuerpo anti-PD-1 y las células CART-EGFR residuales in vivo podrían desempeñar un papel en el deterioro de las toxicidades de la inmunoterapia CART133.