En 1996, se diagnosticó a una mujer de 47 años (peso: 62 kg) hepatitis B activa crónica HBeAg positiva. Los parámetros virales, como HBeAg, anti-HBe IgG y carga viral en plasma de muestras congeladas, se midieron simultáneamente por un único operador para reducir las variaciones intra e inter-ensayo. HBeAg y anti-HBe se determinaron por electroquimioluminiscencia (ELECSYS 2010, Roche Diagnostic). Los niveles de carga viral de HBV se determinaron por PCR en tiempo real (COBAS TaqMan Roche Molecular Systems, rango dinámico de 30 IU/ml a 110,000,000 IU/ml) []. La inflamación hepática se midió por los niveles de alanina aminotransferasa (ALT) en suero. Para el análisis de la secuencia, se secuenciaron los genes pol y preC-core del HBV con los cebadores que se describen más arriba []. El análisis se realizó con un instrumento ABI3100 (Applied Biosystems) y las secuencias introducidas en este trabajo, así como las obtenidas de la base de datos GenBank, se alinearon con ClustalX v1.83 [] y se editaron con Bioedit v7.0.9.0 [] El genotipo del HBV se evaluó mediante inferencia filogenética utilizando el algoritmo de unión de vecinos con el modelo de evolución molecular de dos parámetros de Kimura en el software MEGA v3.1 [] Se obtuvieron secuencias de ambos genes en diferentes momentos durante la terapia antiviral. Se realizó un análisis clonal más detallado del gen pol del VHB en siete aislados virales seleccionados de muestras de suero recogidas durante terapias secuenciales. Cada producto de PCR seleccionado del gen pol se clonó en el vector pGEM-T Easy de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega, Wisconsin, EE. UU.) y al menos 15 clones se analizaron adicionalmente mediante secuenciación. Esto permitió analizar la evolución de las cuasiespecies virales bajo las sucesivas presiones antivirales basándose en el análisis del gen pol. Las intervenciones de tratamiento anti-HBV acompañadas por la carga viral de HBV y la cinética del nivel ALT se representan en la figura. La terapia se inició cuando la carga viral de HBV subió a 6.5 × 106 IU/ml. En 1998, cuando el paciente fue tratado con IFN-[alpha] 5 MU tres veces por semana durante 30 semanas, el nivel de ADN de HBV fue menor que el límite de detección. Esta terapia se interrumpió y se reemplazó en 1999 por lamivudina (150 mg una vez al día). Después de 2 años de tratamiento continuo, el ADN de HBV fue detectable (15.5 × 106 IU/ml). HBeAg permaneció negativo con anti-HBe detectable durante este período de tratamiento. En 2001, después de una interrupción de 6 meses, el nivel de ADN de HBV evidenció un brote posterior al tratamiento (1 × 108 IU/ml). Al final de 2003, se reintrodujo la terapia con lamivudina (150 mg una vez al día). Se acompañó de un evento raro de reversión a un perfil HBeAg positivo/anti-HBe negativo, que permaneció detectable durante dos años. La carga viral alcanzó 3.1 × 106 IU/ml en este punto. Diez meses después, en 2006, el régimen de lamivudina fue sustituido por adefovir monoterapia (10 mg/día). Inicialmente, los niveles de carga viral eran bajos (8,5 × 104 IU/ml) pero después de 48 semanas de terapia estos niveles alcanzaron 7,15 × 106 IU/ml. Los niveles ALT eran normales durante este intervalo. La reactivación de la replicación del HBV se asumió considerando la detección simultánea de HBeAg/anti-HBe [] y la alta replicación detectada. La concurrencia de HBeAg y anti-HBe no parece ser poco común entre los pacientes que no han recibido tratamiento antiviral, pero su prevalencia en pacientes que han recibido tratamiento es desconocida. Este patrón serológico se ha relacionado con un daño hepático extenso y una lesión hepática inmunomediada grave y la consiguiente disfunción []. Seis meses después, el nivel ALT aumentó ligeramente (1,5 × límite superior normal - UNL -) y se instituyó la monoterapia con entecavir (1 mg diario). Después de 5 meses de monoterapia con entecavir, se agregó tenofovir (300 mg una vez al día) al régimen de tratamiento para la doble terapia. El ADN del VHB disminuyó a 1 × 105 IU/ml durante cuatro meses, pero tres meses después la carga viral alcanzó > 1.1 × 108 IU/ml. Además, un aumento en el nivel de ALT (20 × UNL) denotó inflamación hepática. Durante las siguientes 48 semanas, la replicación viral disminuyó ligeramente a 6.1 × 106 IU/ml pero se recuperó primero a 3.6 × 107 IU/ml y luego a > 1.1 × 108 IU/ml. Más recientemente (segundo semestre de 2010), los niveles de ADN del VHB fluctuaron entre 4.3 × 104 IU/ml y 4.9 × 107 IU/ml. Al final del seguimiento del estudio, pudimos medir la concentración de tenofovir en plasma mediante cromatografía líquida de alto rendimiento en tres muestras consecutivas 20 horas después de la administración, alcanzando 71.6 ng/ml ± 47.6 (media ± SD). Los niveles ALT-AST permanecieron ligeramente elevados (2 veces el límite superior normal) durante los últimos dos años de seguimiento. Los aislados de HBV del paciente se atribuyeron al genotipo A2, basándose en la relación filogenética entre las secuencias genómicas parciales de HBV de los genes pol y preC-C. Un análisis genotípico longitudinal adicional, que incluyó la composición de cuasispecies de las cepas de HBV aisladas del paciente, reveló la presencia de mutaciones de resistencia basándose en las secuencias del gen pol (Tabla). Al comienzo del tratamiento con lamivudina, el HBV era de tipo salvaje en todos los clones. Después de 2 años de dicha terapia, esta población viral fue reemplazada completamente por la mutación rtM204I, que exhibió de manera homogénea resistencia a la lamivudina. Cuando se interrumpió dicha terapia durante 6 meses, la composición de cuasispecies estuvo formada casi exclusivamente por secuencias de nucleótidos pol de tipo salvaje, excepto por una contribución menor (< 10%) que mostró la mutación I233V asociada a la resistencia a adefovir. Una vez que se reintrodujo la terapia con lamivudina, y hasta que se administró entecavir más tenofovir, se detectaron invariablemente las mutaciones rtL180M y rtM204I, asociadas a la resistencia a la lamivudina. En este último esquema terapéutico, solo se detectaron las mutaciones A181T y T184L, asociadas a la resistencia a la lamivudina y a la entecavir, respectivamente, de manera efímera y con una contribución menor (~5%). Además, se detectaron otras dos variantes en el dominio catalítico de la transcriptasa inversa en el momento de la resistencia a la lamivudina. Estas variantes rtA200V y rtI253V permanecieron presentes durante la terapia con entecavir y también se detectaron en muestras secuenciadas después de la aparición de resistencia durante la terapia con entecavir. La caracterización genómica del VHB en el nivel preC-C mostró la presencia de la doble mutación A1762T y G1764A, que se detectó tempranamente cuando el paciente no estaba tratado, permaneciendo en esta condición durante todo el seguimiento. La mutación T1753C también se detectó de manera consistente. La presencia de estas mutaciones del promotor central también está relacionada con el perfil concurrente antiHBeAg-HBeAg mencionado anteriormente que se encontró en este paciente, como se informó recientemente [].