Η ασθενής είναι ένα κορίτσι, τώρα 11 ετών, γεννημένη τρεις εβδομάδες πρόωρα με καισαρική τομή λόγω εγκάρσιας θέσης, με βάρος γέννησης 2720 g. Δεν υπήρξαν δυσκολίες σίτισης στη βρεφική ηλικία ή αργότερα. Η κινητική και γλωσσική ανάπτυξη ήταν καθυστερημένη: περπάτησε χωρίς στήριξη σε ηλικία 2½ ετών, και σε ηλικία 3 ετών είπε τις πρώτες της λέξεις. Σε ηλικία 10 ετών γνώριζε το αλφάβητο και προσπάθησε να βάλει γράμματα μαζί. Χρησιμοποιούσε πάνες μέχρι την ηλικία 8-9 ετών. Το μοτίβο του ύπνου της ήταν ελαφρώς ακανόνιστο με συχνές αφυπνίσεις. Δεν έχουν ποτέ εντοπιστεί συγγενείς δυσπλασίες ή επιληψία. Έχει κανονικό ανάστημα με μήκος κατά το 25ο-50ο εκατοστημόριο και βάρος κατά το 25ο εκατοστημόριο, αλλά η περιφέρεια του κεφαλιού της ήταν στο κατώτερο φυσιολογικό εύρος (2,5ο-5ο εκατοστημόριο). Τα χαρακτηριστικά του προσώπου της είναι επίσης φυσιολογικά - δεν είναι σαφώς δυσμορφική. Η συμπεριφορά είναι φυσιολογική χωρίς αυτιστικά χαρακτηριστικά, αλλά το βρουξισμό είναι ένα πρόβλημα. Προτιμά την παρέα με τα μικρότερα παιδιά. Το πνευματικό της επίπεδο θεωρείται συγκρίσιμο με ήπιο-μέτριο ΔΑ, επίσημες δοκιμές IQ δεν έχουν γίνει ακόμα. Σε ηλικία 9 ετών, η πλήρης αλληλουχία του εξωμέσου (WES), συγκρίνοντας το παιδί με τις γονικές αλληλουχίες DNA, αποκάλυψε μια νέα παραλλαγή NAA10 (NM_003491.3) c.332 T > G p.V111G, η οποία επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με αλληλούχιση Sanger. Σύμφωνα με άλλες μεταλλαγές NAA10 missense, η αντικατάσταση V111G επηρεάζει ένα ιδιαίτερα συντηρημένο αμινοξύ (Εικ., πίνακες Α και Β). Το NAA10 είναι μια πρωτεΐνη 235 αμινοξέων που προσαρμόζει το χαρακτηριστικό δίπλωμα GNAT που είναι κοινό στις καταλυτικές υπομονάδες NAT. Αυτό το δίπλωμα αποτελείται από έξι ή επτά β-κλώνους και τέσσερις α-ελίξεις (Εικ.). Οι β-κλώνοι 2-5 αποτελούν τον πυρήνα της πρωτεΐνης. Αυτοί οι τέσσερις β-κλώνοι, μαζί με την α2-ελίξη και τον β6-β7 βρόχο που είναι σημαντικοί για τη δέσμευση του υποστρώματος, είναι ιδιαίτερα συντηρημένοι. Το V111 βρίσκεται προς το τέλος του β5-κλώνου και μια βαλίνη σε αυτή τη θέση είναι ιδιαίτερα συντηρημένη στους ομολόγους του NAA10 καθώς και σε αρκετές άλλες καταλυτικές υπομονάδες NAT για τις οποίες έχουν λυθεί οι κρυσταλλικές δομές (Εικ., δεδομένα που δεν παρουσιάζονται (PDB ID: 5K04 (NAA20), 4U9W (NAA40), 3FTY (NAA50), 5ICV (NAA60) και 4LX9 (ssNAT)) [–]. Η πλευρική αλυσίδα του V111 σχηματίζει μια υδροφοβική τσέπη μαζί με τις Y145, M147, L119 και L109. Είναι επίσης σε κοντινή απόσταση (3.7 Å) από την ομάδα θείου του ακετυλο-CoA (AcCoA), η οποία θα μπορούσε να υποδεικνύει ρόλο για το V111 στη θέση του ακετυλο-CoA (Εικ.). Μια γλυκίνη σε αυτή τη θέση δεν θα προκαλέσει καμία στερική σύγκρουση, αλλά η απώλεια της πιο ογκώδους υδροφοβικής πλευρικής αλυσίδας της βαλίνης ενδέχεται να προκαλέσει δομικές μετατροπές που επηρεάζουν τη σταθερότητα της πρωτεΐνης ή τη δέσμευση του ακετυλο-CoA. Για να αξιολογήσουμε λειτουργικά το NAA10-V111G, εκφράσαμε πρώτα το His/MBP-NAA10-WT και το His/MBP-NAA10-V111G σε E.coli, εξαγάγαμε τα ένζυμα και δοκιμάσαμε την in vitro δραστηριότητα του NAT. Σε αντίθεση με το His/MBP-NAA10-WT, ήταν δύσκολο να πάρουμε καλή έκφραση πρωτεΐνης του His/MBP-NAA10-V111G και ένα σημαντικό κλάσμα των εξαγόμενων μορίων του His/MBP-NAA10-V111G eluated στο κενό όγκο της στήλης χρωματογραφίας αποκλεισμού μεγέθους (Εικ., πίνακες Α και Β). Αυτό υποδεικνύει ότι τμήματα της πρωτεϊνικής ένωσης σε μονάδες μεγαλύτερες από 200 kDa, πιθανότατα λόγω μιας μεταβολής της πρωτεϊνικής δομής ή μειωμένης πρωτεϊνικής σταθερότητας. Τα ένζυμα που eluated σε όγκο στήλης που αντιστοιχεί σε μονομερές His/MBP-NAA10-V111G δοκιμάστηκαν για καταλυτική δραστηριότητα και έδειξαν ότι είχαν περίπου 85% μείωση της καταλυτικής δραστηριότητας σε σύγκριση με το His/MBP-NAA10-WT (Εικ., πίνακες Γ και Δ). Λόγω των χαμηλών επιπέδων έκφρασης και της απόδοσης πρωτεΐνης του NAA10-V111G από την Ε. coli μετά από τη μεταφύτευση και την καθαρισμό της πρωτεΐνης, μεταφυτέψαμε κύτταρα HeLa με πλασμίδια που κωδικοποιούν είτε το V5-tagged NAA10-WT είτε το V5-tagged NAA10-V111G και ακολούθως την ανοσοεπιδείνωση (IP) της υπερ-εκφραζόμενης πρωτεΐνης με ένα αντι-V5 αντισώμα. Έπειτα, η δραστηριότητα της NAT στο ιζήμα μετρήθηκε (Εικ. ). Το ΝΑΑ10 και το ΝΑΑ15 σχηματίζουν ένα σύμπλεγμα υψηλής συγγένειας πρωτεΐνης (Εικ. ), και όπως αναμενόταν, το ενδογενές ΝΑΑ15 συγκολλήθηκε με τα υπερ-εκφραζόμενα ΝΑΑ10-WT-V5 και ΝΑΑ10-V111G-V5. Η ποσότητα του ΝΑΑ10 και του ΝΑΑ15 που υπήρχε σε κάθε δείγμα προσδιορίστηκε με SDS-PAGE και Western blotting. Οι ζώνες από το Western blot ποσοτικοποιήθηκαν και η μετρούμενη καταλυτική δραστηριότητα συσχετίστηκε με την ποσότητα του ΝΑΑ10-V5 που υπήρχε στο δείγμα (δηλαδή ένα μείγμα μονομερών ΝΑΑ10 και ΝΑΑ10 σε σύμπλεγμα με ΝΑΑ15 – το σύμπλεγμα NatA), και συσχετίστηκε ξεχωριστά με την ποσότητα του ΝΑΑ15 που υπήρχε στο δείγμα (δηλαδή η ποσότητα του συμπλέγματος NatA μόνο). Τα αποτελέσματα από το πείραμα IP-activity αντιστοιχούσαν καλά με τα προηγούμενα ευρήματά μας (Εικ. ): η ικανότητα του ΝΑΑ10-V111G να ακετυλιώσει το όξινο Ν-τέλος EEEI24 μειώθηκε σημαντικά (Εικ., πίνακες Β και Γ). Ωστόσο, αποκάλυψε και ένα δεύτερο ενδιαφέρον χαρακτηριστικό: Όπως φαίνεται από το Western blot στην Εικ., περισσότερα ΝΑΑ15 συγκολλήθηκαν με το ΝΑΑ10-V111G-V5 σε σύγκριση με το ΝΑΑ10-WT-V5. Αυτό αντικατοπτρίστηκε και στα μέτρα της δραστηριότητας NAT όπου το ανοσοεπιδεσμένο ΝΑΑ10-V111G-V5 έδειξε υψηλότερη παραγωγή NatA προϊόντος (για το NatA υπόστρωμα πεπτιδίου SESS24) σε σύγκριση με το ανοσοεπιδεσμένο ΝΑΑ10-WT-V5 όταν συσχετίστηκε με την ποσότητα του συνολικού ΝΑΑ10-V5 που υπήρχε στο δείγμα (Εικ.). Ωστόσο, όταν συσχετίστηκε με την ποσότητα του ΝΑΑ15 που υπήρχε σε κάθε δείγμα, η παραγωγή του προϊόντος NatA ανά ΝΑΑ15 μόριο (και συνεπώς το σύμπλεγμα NatA) ήταν περίπου ίση (Εικ.). Καθώς το ΝΑΑ10 έχει 1000 φορές χαμηλότερη δραστηριότητα ΝΑΑ προς τα υποστρώματα NatA σε σύγκριση με το σύμπλεγμα NatA [], η συμβολή του ΝΑΑ10 σε μονομερή μορφή στην ακετυλίωση του SESS24 είναι ελάχιστη. Συνολικά, αυτό υποδεικνύει ότι το ΝΑΑ10-V111G έχει μειωμένη καταλυτική δραστηριότητα σε μονομερή μορφή, αλλά όχι σε σύμπλεγμα με το ΝΑΑ15. Για να εκτιμηθεί ο ρυθμός μετατροπής της πρωτεΐνης NAA10-WT και NAA10-V111G, εκφράσαμε τη V5-tagged NAA10-WT και NAA10-V111G σε κύτταρα HeLa και εκτελέσαμε πειράματα με cycloheximide-chase. Όπως φαίνεται από την εικόνα, η NAA10-V111G-V5 έχει υψηλότερο ρυθμό μετατροπής από τη NAA10-WT-V5. 2 ώρες μετά από την επεξεργασία με cycloheximide, η μέση ποσότητα της NAA10-V111G-V5 μειώθηκε κατά περίπου 80%, ενώ τα μόρια NAA10-WT-V5 μειώθηκαν κατά 20% σε σχέση με την ποσότητα των μορίων NAA10 πριν από την επεξεργασία με cycloheximide. Αν και η ποσότητα της NAA10-V111G-V5 μειώθηκε δραστικά μετά από 2 ώρες, το επίπεδο της NAA10-V111G-V5 φαίνεται να σταθεροποιείται περίπου στο 20%. Η υπερβολικά αυξημένη έκφραση της NAA10-V111G-V5 είναι παρούσα τόσο σε μια ασταθή μονομερική μορφή που αποικοδομείται γρήγορα όσο και σε σύμπλοκο με τη NAA15, η οποία σταθεροποιεί το ένζυμο και το προστατεύει από την αποικοδόμηση.