Ένας 74χρονος άνδρας παρουσιάστηκε στον γενικό ιατρό του τον Αύγουστο του 2006 παραπονούμενος για απώλεια μνήμης και παραπέμφθηκε στον νευρολόγο. Έδειξε ταχεία παγκόσμια γνωστική πτώση που σχετίζεται με επιθετικότητα, παράξενη συμπεριφορά και απώλεια γλώσσας. Αυτό συνοδεύτηκε από σοβαρή ανομία, αποχαύνωση και βαθμολογία 10/30 στο MMSE. Δεν υπήρχαν εστιακά σημεία, μυοκλονία ή αταξία. Η κλινική επιδείνωση ήταν πολύ γρήγορη και τον Δεκέμβριο του 2006 ήταν σε ένα σύνδρομο ακινησίας-μουτισμού με ανώμαλη στάση. Δύο μαγνητικές τομογραφίες του κρανίου (MRI), τον Οκτώβριο και τον Δεκέμβριο του 2006, συμπεριλαμβανομένων των ακολουθιών T1, T2, FLAIR και DWI, έδειξαν μέτρια σημεία ατροφίας του εγκεφάλου αλλά δεν υπήρχε αύξηση του ανώμαλου φλοιού ή του σήματος των βασικών γαγγλίων. Το ηλεκτροεγκεφαλογράφημα (EEG) δεν ήταν διαγνωστικό και το επίπεδο της πρωτεΐνης 14-3-3 στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (CSF) ήταν φυσιολογικό. Ο ασθενής πέθανε τον Μάρτιο του 2007. Το οικογενειακό ιστορικό άνοιας περιελάμβανε έναν 80χρονο αδελφό που είχε διαγνωστεί με πιθανή νόσο του Αλτσχάιμερ. Δεν βρέθηκαν μεταλλάξεις στο ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης μετά την αλληλούχιση του γονιδίου πρωτεΐνης πριόν (PRNP). Παρατηρήθηκε ετεροζυγωσία μεθειονίνης βαλίνης (MV) στο κωδικόνιο 129. Η μέτρια έως ήπια σπογγώδης μετατροπή ήταν παρούσα στον νεοφλοιό, στον πυρήνα του εγκεφάλου/παλαίοφλοιό και στον θάλαμο, με τις βλάβες να είναι πιο εμφανείς στον πυρήνα του εγκεφάλου και στον μετωπιαίο φλοιό (Εικόνα και). Οι συγκλίνουσες κοιλότητες δεν βρέθηκαν σε καμία περιοχή. Εκτός από μερικές εστιακές κοιλότητες στο βαθύτερο μοριακό στρώμα, ο μετωπιαίος φλοιός ήταν κατά τα άλλα άσημος (Εικόνα). Οι νευρώνες ήταν σε μεγάλο βαθμό διατηρημένοι στον μετωπιαίο φλοιό και στους υποφλοιώδεις γαγγλίοες, αν και σπάνια παρατηρήθηκε εστιακή αστρογλοίωση (Εικόνα). Η μέτρια έως ήπια μικρογλοίωση ήταν παρούσα στον μετωπιαίο φλοιό και στους υποφλοιώδεις γαγγλίοες, και στην υποφλοιώδη λευκή ουσία, αντίστοιχα (Εικόνα και). Η ανοσοχρωματική σήμανση της PrP χωρίς προεπεξεργασία με πρωτεάση Κ έδειξε ισχυρή χρώση που χαρακτηριζόταν από λεπτές διάσπαρτες αποθέσεις (συναπτικού τύπου) και ακανόνιστες κοκκώδεις, συχνά συγκλίνουσες, αποθέσεις που θα μπορούσαν να χαρακτηριστούν ως διάχυτη συναπτική (Εικόνα και). Τα περινευρικά και τα εγκεφαλονωτιαία κατάλοιπα τύπου πλάκας απουσίαζαν. Μετά την προεπεξεργασία με PK, η μεγάλη πλειοψηφία της χρώσης εξαφανίστηκε, εκτός από μερικές κοκκώδεις αποθέσεις PrP που ήταν ανθεκτικές στην πρωτεάση Κ (Εικόνα και). Ο εγκέφαλος έδειξε διακριτό συναπτικό τύπο τύπου PrP στα μοριακά και κοκκώδη στρώματα που εξαφανίστηκε μετά την προεπεξεργασία με PK. Η ευαισθησία στην προεπεξεργασία με PK απεικονίστηκε καλύτερα σε διαδοχικές τομές με και χωρίς προεπεξεργασία με PK (Εικόνα). Οι παράλληλες τομές που είχαν χρωματιστεί με το αντίσωμα 3F4 έδειξαν σημαντική μείωση της ανοσοχημικής αντίδρασης PrP, όπως αξιολογήθηκε με πυκνομετρία, που αφορούσε το 70-80% της συνολικής PrP στις τομές του ιστού. Αυτό επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με την επώαση των τομών με το αντίσωμα 1E4 και τη σύγκριση του ανοσοχημικού μοτίβου της PrP ενός περιστατικού με ΣκΠ MV1 με το μοτίβο του προσβεβλημένου ατόμου. Όπως φαίνεται στην Εικόνα, η ανοσοχημική αντίδραση PrP 3F4 και 1E4 στον κοινό τύπο MV1 έδειξε ανθεκτική ανοσοχημική αντίδραση PrP (Εικόνα). Σε αντίθεση, η ανοσοχημική αντίδραση 3F4 και 1E4 καταργήθηκε σχεδόν μετά την προεπεξεργασία με PK στο προσβεβλημένο άτομο (Εικόνα). Επιπλέον των αλλαγών αυτών, υπήρχαν νευροϊνωδικοί κόμβοι και προ-κόμβοι, καθώς και κόκκοι (σπόροι), στον ενδορινικό και περιρινικό φλοιό, στο υποικύλωμα και στις περιοχές CA1 και CA3 του ιππόκαμπου. Λίγοι προ-κόμβοι και κόκκοι παρατηρήθηκαν και στην αμυγδαλή. Οι αλλαγές αυτές συνοδεύονταν από λίγους υπερφωσφορυλιωμένους αποθέματα ταύ στα νευρώνες του οδοντωτού φλοιού, από σπειροειδείς σχηματισμούς στη λευκή ουσία του κροταφικού λοβού και από περι-εγκρατινούς αστροκύτταρα. Διάσπαρτοι α-β-κρυσταλλινικοί ανοσοενεργοί νευρώνες με διόγκωση υπήρχαν στον ενδορινικό φλοιό και στην αμυγδαλή. Η παθολογία του ταύ ήταν σύμφωνη με το στάδιο ΙΙΙ της νόσου Αλτσχάιμερ και το στάδιο 3 της αργιοφιλικής νόσου κόκκων. Οι πλάκες αμυλοειδούς και οι α-συνουκλεϊνικές εγκλείσεις απουσίαζαν. Δεν διαπιστώθηκαν ανωμαλίες με αντι-TDP-43 αντισώματα. Η τυπική διαδικασία Western-blot PrP (10% ομογενοποιημένο εγκεφάλου και τελική συγκέντρωση PK 440 μg/ml) δεν κατάφερε να ανιχνεύσει PrPSc. Η αύξηση του όγκου που φορτώθηκε στο πήκτωμα από 5 σε 10 μl έδωσε ένα εξαιρετικά ασθενές σήμα που αντιστοιχούσε σε 24 και 19 kDa κάτω από χρόνους έκθεσης σε κορεσμένη μεμβράνη (Σχήμα). Οι μειώσεις των συγκεντρώσεων PK (440, 100 και 50 μg/ml) έδειξαν αύξηση του σήματος PrPSc, που υποδήλωνε μια PK-ευαίσθητη πρωτεΐνη πριόν (Σχήμα). Ακόμα και τότε, μόνο δύο ζώνες των 24 και 19 kDa ήταν ορατές. Μετά την αύξηση του ποσοστού ομογενοποιημένου εγκεφάλου σε 20%, το ίδιο μοτίβο δύο ζωνών ελήφθη. Χρησιμοποιώντας το κιτ TeSeE®, που χαρακτηρίζεται από πιο ήπιες συνθήκες πέψης των πρωτεϊνών PK και ακολουθείται από βήματα καθαρισμού και συγκέντρωσης της πρωτεΐνης και χρώση με το Mab Sha31, διαπιστώθηκε η παρουσία δύο μη αναμενόμενων ζωνών 21 και 16 kDa (Σχήμα). Αυτό το προφίλ ζώνης παρατηρήθηκε σε όλες τις περιοχές του εγκεφάλου και αποτέλεσε ένα εντυπωσιακό αποτέλεσμα, καθώς το μοριακό τους βάρος ήταν διαφορετικό από αυτό που είχε προηγουμένως ανιχνευθεί με τα Mab 3F4 και 6H4. Η εκτέλεση ενός συνδυασμού πέψης, καθαρισμού και συγκέντρωσης του δείγματος σύμφωνα με τις συστάσεις του κιτ TeSeE®, μαζί με την ανίχνευση με τα αντισώματα 3F4 και 6H4, οδήγησε σε ένα νέο πρότυπο. Όχι μόνο οι προηγούμενες ζώνες των 24, 21, 19 και 16 kDa ήταν παρούσες σε κάθε ένα από τα δείγματα, αλλά επίσης μια πολύ αδύναμη ζώνη των 28 kDa και ένα τμήμα μεγέθους περίπου 6kDa παρατηρήθηκε σε ορισμένες περιοχές του εγκεφάλου (Σχήμα). Επιπλέον, ελήφθησαν διαφορές στην ένταση του σήματος με τα αντισώματα 3F4 και 6H4 που υποδεικνύουν διαφορική συγγένεια για το PrPSc, η οποία θα μπορούσε να ερμηνευθεί ως μια διαφορετική σύσταση πρωτεΐνης στην οποία το epitope που συνδέεται με το Mab 3F4 ήταν πιο εκτεθειμένο από το epitope που συνδέεται με το Mab 6H4. Η ανάλυση της απογλυκοζυλίωσης αποκάλυψε τρεις απογλυκοζυλιωμένες ισομορφές των 19, 16 και 6 kDa, οι οποίες ήταν πιο έντονες στον φλοιό (παρεγκεφαλικό, μετωπιαίο και κροταφικό) και πιο αδύναμες στον ινιακό φλοιό και το putamen/globus pallidus. Στην περιοχή του θαλάμου, ανιχνεύτηκαν δύο ζώνες, μία πιο έντονη των 19 kDa και μία πιο αδύναμη των 16 kDa. Τέλος, το εγκεφάλου ήταν η μόνη περιοχή όπου παρατηρήθηκε μία απογλυκοζυλιωμένη ζώνη των 19 kDa (εικόνα), παρόμοια με αυτή που βρέθηκε στην περίπτωση της νόσου τύπου 2. Ωστόσο, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε το ενδεχόμενο το εύρημα αυτό να ήταν αποτέλεσμα της παρουσίας μικρής ποσότητας PrPSc και υποεκπροσώπησης των άλλων ζωνών, όπως παρατηρήθηκε στον θάλαμο, όπου μία ζώνη μεγέθους 16 kDa παρατηρήθηκε μόνο σε μεγαλύτερους χρόνους έκθεσης της ταινίας. Η αξιολόγηση της ευαισθησίας στη χώνευση PK επιτεύχθηκε με τη μέτρηση της απορρόφησης του PrPSc πριν και μετά την αγωγή με πρωτεάση K χρησιμοποιώντας το τεστ IDEXX HerdChek BSE. Αυτή η τεχνολογία βασίζεται στην επιλεκτική σύλληψη του PrPSc από ένα συγκεκριμένο χημικό πολυμερές μέσω πολυιοντικών αλληλεπιδράσεων παρουσία του PrPC από ένα ομογενοποιημένο δείγμα εγκεφάλου. Οι τιμές απορρόφησης μειώνονται με τις σειριακές αραιώσεις, επομένως μπορεί να θεωρηθεί ότι η ποσότητα του PrPSc είναι άμεσα ανάλογη προς την απορρόφηση. Ο στόχος αυτού του πρωτοκόλλου ήταν η εκτέλεση της σχετικής ποσοτικοποίησης του PrPSc χωρίς αγωγή με πρωτεάση. Θεωρούμε ότι η εισαγωγή ενός βήματος χώνευσης θα μπορούσε να είναι χρήσιμη για την εύκολη αξιολόγηση της σχετικής αντίστασης στη χώνευση PK. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι τιμές απορρόφησης μειώθηκαν μετά την αγωγή PK σε όλα τα δείγματα (Πίνακας). Για την εγκεφαλοπάθεια πολλαπλών ελλειμμάτων (MIE) και την sCJD VV2, η ανίχνευση του σήματος μειώθηκε κατά 4,32% και 2,02%, αντίστοιχα, αλλά οι μειώσεις δεν ήταν στατιστικά σημαντικές. Αντιθέτως, τα δείγματα από τον πρόδρομο και την sCJD MM1 παρουσίασαν στατιστικά σημαντική (p < 0,005) μείωση του σήματος κατά 79,82% και 22,68%, αντίστοιχα. Οι τιμές απορρόφησης για την MIE ήταν κάτω από το όριο, στο ίδιο επίπεδο με τους αρνητικούς ελέγχους. Οι υπόλοιπες τιμές ήταν πάνω από το όριο. Τα διαφοροποιημένα αυτά επίπεδα μείωσης του σήματος υποδεικνύουν τρία επίπεδα αντίστασης στη χώνευση της PK: υψηλή, ενδιάμεση και χαμηλή. Υψηλή αντίσταση στη χώνευση της PK θα υποδεικνύεται από χαμηλό ποσοστό μείωσης του σήματος, όπως παρατηρήθηκε για το sCJD VV2. Στην περίπτωση αυτή, η μείωση του σήματος κατά 2% θα υποδεικνύει ότι η χώνευση της PK θα υποβαθμίσει μόνο ένα ελάχιστο κλάσμα της PrPSc, υποδεικνύοντας έτσι υψηλή αντίσταση της ανώμαλης πρωτεΐνης πριόν. Ενδιάμεση αντίσταση θα υποδεικνύεται από ελαφρώς υψηλότερο ποσοστό μείωσης του σήματος, όπως παρατηρήθηκε για το sCJD MM1, στο οποίο το 22% θα υποδεικνύει υψηλότερο κλάσμα της PrPSc που μπορεί να υποβαθμιστεί από ό,τι παρατηρήθηκε στην προηγούμενη περίπτωση. Αυτό θα υποδεικνύει έναν τύπο πρωτεΐνης που είναι μόνο ελαφρώς ευαίσθητος στην υποβάθμιση με πρωτεάσες, ανάλογα με την περιοχή του εγκεφάλου. Διεξάγονται περαιτέρω έρευνες για να διασαφηνιστεί αν αυτό το επίπεδο υποβάθμισης σχετίζεται με τον τύπο πρωτεΐνης MM1 ή με φαινόμενο που αφορά ειδικά αυτό το άτομο. Τέλος, χαμηλή αντίσταση στη χώνευση της PK θα υποδεικνύεται από υψηλό ποσοστό μείωσης του σήματος, όπως το 79% που παρατηρήθηκε στο άτομο που αποτέλεσε αντικείμενο της μελέτης, υποδεικνύοντας ότι ένα υψηλό κλάσμα της PrPSc είναι υποβαθμίσιμο. Αυτό υποδεικνύει την ύπαρξη τύπων ανώμαλων πρωτεϊνών πριόν που είναι εξαιρετικά ευαίσθητοι στην υποβάθμιση με πρωτεάσες και που ενδεχομένως να μην λαμβάνονται υπόψη από μεθόδους ανίχνευσης που βασίζονται στην χαρακτηριστική αντίσταση πρωτεάσης της παθολογικής πρωτεΐνης πριόν.