Ένας 11χρονος, άθικτος αρσενικός Γερμανικός Ποιμενικός Σκύλος (GSD) παραπέμφθηκε στην υπηρεσία έκτακτης ανάγκης του Τμήματος Κλινικών Επιστημών των Ζώων Συντροφιάς της Σχολής Κτηνιατρικής του Πανεπιστημίου της Ουτρέχτης με ιστορικό οξείας έναρξης δύσπνοιας και γενικευμένης αδυναμίας 2 ημερών. Ο εμβολιασμός και η αποπαρασίτωση έγιναν τακτικά. Ο σκύλος είχε επισκεφθεί τη Νότια Ευρώπη 6 μήνες πριν από την παρουσίαση. Δεν χορηγήθηκαν φάρμακα πριν από την ανάπτυξη των κλινικών σημείων και δεν αναφέρθηκαν περιβαλλοντικές συνθήκες που θα μπορούσαν να προκαλέσουν δύσπνοια (π.χ. καπνός, έκθεση σε οργανικούς διαλύτες, σκόνη). Η φυσική εξέταση έδειξε έναν ανταποκρινόμενο αλλά ληθαργικό σκύλο με γενικευμένη αδυναμία, σοβαρή δύσπνοια, κυανωτικές βλεννογόνους μεμβράνες, παρατεταμένο χρόνο επαναπλήρωσης τριχοειδών, αδύναμα περιφερικά σφυγμικά σήματα, ταχυκαρδία (καρδιακός ρυθμός 180 χτύποι/λεπτό) και ένα βαθμό ένα από έξι συστολικά σφυρίγματα με σημείο μέγιστης έντασης πάνω από την δεξιά καρδιακή κορυφή. Ακούστηκαν σκληροί ήχοι στους πνεύμονες κατά την ακρόαση των πνευμόνων. Ο πλήρης αριθμός αίματος (CBC) έδειξε μια ήπια ώριμη λευκοκυττάρωση (λευκά αιμοσφαίρια: 18,9 × 109/L; διάστημα αναφοράς 4,5–14,6 × 109/L) και ένα αιματοκρίτη 56% (διάστημα αναφοράς 42–61%). Η βιοχημεία δεν έδειξε ανωμαλίες. Η ανάλυση αερίων αρτηριακού αίματος έδειξε σοβαρή υποξαιμία (PaO2: 48,5 mm Hg; διάστημα αναφοράς 85–103 mm Hg) και ήπια υποκαπνία (PaCO2: 27,0 mm Hg; διάστημα αναφοράς: 32–43 mm Hg). Η υποψία για την υποκαπνία ήταν η υπερвенτήλωση. Οι συγκεντρώσεις D-dimer και αντιθρομβίνης ήταν εντός των ορίων αναφοράς. Η δοκιμή αντιγόνου διροφιλάριας immitis (SNAP® Heartworm RT Test, IDEXX Laboratories) και η εξέταση κοπράνων (τεχνική απομόνωσης βακτηρίων με επίπλευση και Baermann) ήταν αρνητικές. Οι ακτινογραφίες θώρακα έδειξαν διαστολή του κορμού της πνευμονικής αρτηρίας και δεξιά καρδιακή υπερτροφία (Εικ. ) Η ηχοκαρδιογραφία ήταν πολύ δύσκολη λόγω του άγχους και του λαχάνιασμα του σκύλου και συνεπώς περιορίστηκε. Εμφάνισε σοβαρή δεξιά κοιλιακή διαστολή, ήπια ομοιόμορφη διαστολή της κύριας πνευμονικής αρτηρίας, συστολική ισοπέδωση του μεσοθωρακίου και μέτρια τριγλώχινη παλινδρόμηση (Εικ. α). Η εφαρμογή του τροποποιημένου τύπου του Βέρνιου για την ταχύτητα του τριγλώχινη παλινδρόμησης έδειξε εκτιμώμενη συστολική πίεση της πνευμονικής αρτηρίας 77 mm Hg, βαθμού σοβαρότητας PH (αναφορά < 25 mm, σοβαρή > 75 mm Hg) ([]) Οι διαστάσεις της αριστερής κοιλίας μειώθηκαν σημαντικά, σύμφωνα με την εξάντληση όγκου της αριστερής πλευράς. Μια ηχοκαρδιογραφία με σκιαγραφικό μέσο έγινε αρνητική, αποκλείοντας έτσι την ενδο- και εξωκαρδιακή δεξιά προς αριστερή μετατόπιση. Για την αντιμετώπιση της σοβαρής υποξαιμίας και της PH ο σκύλος τοποθετήθηκε σε κλουβί οξυγόνου με εμπνευσμένη συγκέντρωση οξυγόνου μεταξύ 40 και 50%. Επιπλέον, χορηγήθηκε από το στόμα 1,5 mg/kg/8 ωρών σιλδεναφίλη (Viagra®, Pfizer, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ) και 0,25 mg/kg/12 ωρών πιμομπεντάν (Vetmedin®, Boehringer Ingelheim, Γερμανία). Αυτή η θεραπεία δεν επηρέασε σημαντικά την κλινική κατάσταση του σκύλου. Ωστόσο, η αρτηριακή υποξαιμία βελτιώθηκε ήπια μετά την πρώτη ημέρα της θεραπείας (PaO2 αυξήθηκε από 48,5 σε 53 mm Hg, διάστημα αναφοράς 85–103 mm Hg). Το ηχοκαρδιογράφημα επαναλήφθηκε την τρίτη ημέρα της θεραπείας και οι ηχοκαρδιογραφικές αλλαγές και η σοβαρότητα της PH μειώθηκαν σημαντικά. Η δεξιά κοιλιακή διαστολή μειώθηκε δραματικά, το μεσοθωρακικό διάφραγμα δεν ήταν πλέον πεπλατυσμένο και η πίεση του τριγλώχινη παλινδρόμησης μειώθηκε από 77 mm Hg σε 41 mm Hg (αναφορά < 25 mm Hg) (Εικ. β). Επομένως, η θεραπεία με πιμομπεντάν και σιλδεναφίλη συνεχίστηκε κατά τη διάρκεια της νοσηλείας (7 ημέρες). Ως περαιτέρω διαγνωστικά βήματα, 4 ημέρες μετά την αρχική παρουσίαση, πραγματοποιήθηκαν μια (προ- και μετα-εξέταση) υπολογιστική τομογραφία (CT) με άπνοια, ακολουθούμενη από μια χειρουργική βιοψία πνεύμονα στην ίδια αναισθητική συνεδρία. Χρησιμοποιήθηκε ένας υπολογιστής τομογραφίας με σίγμα (Philips Secura, Philips NV, Eindhoven, Ολλανδία). Οι τεχνικές ρυθμίσεις περιλάμβαναν σίγματα με σίγμα 3 mm, 120 kV, 200 mA, οπτικό πεδίο 292 mm, μήτρα 512 × 512 και αλγόριθμο υψηλής χωρικής συχνότητας. Στις εικόνες CT, το πνευμονικό παρέγχυμα έδειξε λεπτές κεντρικές οζίδια από υαλοειδές και μια διευρυμένη πνευμονική αρτηρία. Οι γραμμές του διαφράγματος, η πλευρική συλλογή και η λεμφαδενοπάθεια απουσίαζαν (α, β). Τα ευρήματα CT ήταν συμβατά με PH χωρίς οριστική διάγνωση. Μετά την εξέταση CT, μια βιοψία πνεύμονα από το αριστερό κρανιακό λοβό του πνεύμονα (3 × 2 cm) ελήφθη για ιστοπαθολογική εξέταση με μίνι-θωρακτοτομία. Αμέσως μετά από αυτή τη διαδικασία ξεκίνησε θεραπεία με δεξαμεθαζόνη (0,25 mg/kg q24 h I.V., Rapidexon ®, Eurovet Animal Health, Bladel, Ολλανδία) ως ύστατη λύση ενώ τα αποτελέσματα της ιστοπαθολογικής εξέτασης ήταν εκκρεμή (3 ημέρες). Η ιστοπαθολογία της χειρουργικής βιοψίας του πνεύμονα έδειξε μέτρια χρόνια διάμεση ιστιοκυτταρική πνευμονία άγνωστης αιτιολογίας και ατελεκτασία με χρώσεις αιματοξυλίνης και εωσίνης, περιοδικού οξέος-Σίφφ και Βαν Γίεσον. Οι αγγειακές αλλαγές αρχικά δεν προσδιορίστηκαν με σαφήνεια. Λόγω της κακής ανταπόκρισης στην έναρξη της θεραπείας και της υποψίας κακής πρόγνωσης με βάση τα ιστοπαθολογικά αποτελέσματα, το σκυλί θανατώθηκε. Η αυτοψία πραγματοποιήθηκε με τη συναίνεση του ιδιοκτήτη. Η γενική παθολογία των πνευμόνων έδειξε μέτρια κατάρρευση των πνευμόνων με διάχυτη κηλιδώδη εμφάνιση με πολλαπλές σκούρες κόκκινες εστίες 1 × 1 × 3 mm, και μικρούς αριθμούς λευκών εστιών 1 × 1 × 1 mm, συχνά περιβαλλόμενες από μια σκούρα κόκκινη ζώνη (οριοθέτηση) που ήταν τυχαία κατανεμημένη σε όλους τους λοβούς των πνευμόνων (Εικ. ). Η συνήθης ιστοπαθολογία των πνευμόνων έδειξε πολυκεντρική αγγειακή αναμόρφωση. Για να γίνει διάκριση μεταξύ μικρών αρτηριών και φλεβών, που είναι απαραίτητη για τη διάγνωση της ΠΑΥ, προστέθηκε μια πρόσθετη χρώση που απεικονίζει ελαστικές ίνες και κολλαγόνο (Resorcin Fuchsin του Weigert) για τον εντοπισμό ελαστικών ελατηρίων. Σε αυτό το σκυλί, όπως και στους ανθρώπους με ΠΑΥ, επηρεάστηκαν και τα τρία διαμερίσματα (αρτηρίες, φλέβες και τριχοειδείς) της πνευμονικής μικροκυκλοφορίας, αν και οι αλλαγές στο φλεβικό σύστημα των πνευμόνων ήταν οι πιο έντονες. Οι φλεβικές βλάβες περιλάμβαναν σοβαρή ομόκεντρη υπερπλασία του εσωτερικού χιτώνα, μερική έως πλήρη απόφραξη του εσωτερικού χιτώνα (Εικ., ) και μεταθρομβωτική επανακαναλοποίηση (Εικ. γ). Οι τριχοειδείς βλάβες οργανώθηκαν σε εστίες, οι οποίες ήταν πιο εμφανείς δίπλα σε αναμορφωμένες τριχοειδείς και χαρακτηρίστηκαν από υπερπλασία των ελαστικών ενδοθηλιακών κυττάρων (παρόμοια με την ΠΑΧ) (Εικ., β, δ). Η τμηματική συμφόρηση των τριχοειδών των πνευμονικών τριχοειδών ήταν επίσης τακτικά συνδεδεμένη με τις εστίες της ΠΑΧ (Εικ. ). Οι αρτηριακές βλάβες έμοιαζαν με εκείνες της ΠΑΥ με ομόκεντρη υπερπλασία του εσωτερικού χιτώνα από αυξημένη εξωκυτταρική μήτρα και μερική υπερτροφία του μεσαίου χιτώνα, αλλά απουσίαζαν οι πολύπλοκες πλεκτιμορφικές βλάβες (Εικ. ). Τα ευρήματα αυτά ήταν σύμφωνα με τα ευρήματα που περιγράφηκαν από τους Williams et al. [] και συνεπώς με το ανθρώπινο ισοδύναμο της ΠΑΥ. Το γονιδιακό DNA της υπόθεσης απομονώθηκε από αίμα EDTA χρησιμοποιώντας ένα ημιαυτόματο ρομπότ εκχύλισης Chemagen (PerkinElmer Chemagen Technologie GmbH) και αποθηκεύτηκε στους -20 °C. Περίπου 6 χρόνια αργότερα, το γονιδιακό DNA της υπόθεσης και ένα μη σχετιζόμενο υγιές GSD αναλύθηκαν με πλήρη αλληλούχιση του γονιδιώματος. Η ακεραιότητα του DNA ελέγχθηκε σε ένα Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, ΗΠΑ) και ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Qubit dsDNA HS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΗΠΑ). Οι βιβλιοθήκες DNA προετοιμάστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ προετοιμασίας βιβλιοθήκης TruSeq Nano (Kit προετοιμασίας βιβλιοθήκης TruSeq Nano, Illumina, Σαν Ντιέγκο, ΗΠΑ) χρησιμοποιώντας 200 ng εισόδου gDNA. Οι πληροφορίες αλληλούχισης ολόκληρου του γονιδιώματος με κάλυψη 30 × ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα όργανο HiSeqX Ten (όργανο HiSeqX Ten, Illumina, Σαν Ντιέγκο, ΗΠΑ) και 2 × 150 ζευγαρωμένες βάσεις ανά άκρο. Τα δεδομένα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με την ιδιόκτητη διαδικασία μας v1.2.1 () συμπεριλαμβανομένης της ανάλυσης σωματικών μεταλλάξεων (Strelka, VarScan, FreeBayes, και MuTect) και ενός εργαλείου ανάλυσης γονιδιώματος (GATK v. 3.2.2) [] σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές βέλτιστων πρακτικών []. Οι αναγνώσεις αλληλουχίας χαρτογραφήθηκαν στο Canine Reference Genome (CanFam 3.1) χρησιμοποιώντας την ευθυγράμμιση Burrows-Wheeler με τις μέγιστες ακριβείς αντιστοιχίες (BWA-MEM) v0.7.5a [] ακολουθούμενη από σήμανση διπλότυπων, συγχώνευση λωρίδων και επανακαθορισμό των indels. Δεν έγινε επαναβαθμονόμηση βάσης. Στην ιατρική των ανθρώπων, οι μεταλλάξεις στα BMPR2, ACVRL1, ENG, KCNK3, CAV-1, και SMAD9 θεωρήθηκαν ότι είναι αιτιώδεις για μια αυτοσωματική κυρίαρχη μορφή της ΠΑΥ [] Αυτά τα γονίδια συμπεριλήφθηκαν στις αναλύσεις για την πρόληψη των ελλιπών μεταλλάξεων λόγω φαινοτυπικής λανθασμένης ταξινόμησης. Η σύγκριση των ασθενών και των υγιών GSD αποκάλυψε 196 μοναδικές ενδογενείς παραλλαγές. Η σύγκριση της αλληλουχίας του EIF2AK4 στους ασθενείς και στους υγιείς GSD αποκάλυψε 124 μοναδικές παραλλαγές, από τις οποίες οι 9 ήταν στην 3`-UTR, οι 112 ήταν ενδογενείς και οι 3 ήταν εξωγενείς παραλλαγές. Οι ασθενείς ήταν ομόζυγοι μεταλλαγμένοι για c.2961T>C και c.1266G>A, μια ετεροζυγώτικη παραλλαγή βρέθηκε στο c.2092G>A. Η επικύρωση της παραλλαγής έγινε με αλληλούχιση Sanger σε προϊόντα PCR από το γονιδίωμα DNA χρησιμοποιώντας Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). Μετά από επεξεργασία με την ενζυμική νουκλεάση Ι, οι αλληλουχίες DNA αναλύθηκαν με χρήση του Lasergene (έκδοση 12.0 DNASTAR). Τέσσερις από τις πέντε επιπλέον GSD, άγνωστες για οποιαδήποτε μορφή αναπνευστικού στρες και ηλικίας ≥ 10 ετών, αποκάλυψαν την ίδια γονιδιακή μορφή με τους ασθενείς και συνεπώς αποκλείστηκαν ως αιτιώδεις παραλλαγές για την PVOD.