Ένα αρσενικό Eurasian otter ηλικίας 4 ετών που γεννήθηκε το 2015 στο «Sendaviva, Natural Park of Navarra» (42°11′31″N, 1°09′54”O) (Βόρεια Ανατολική Ισπανία) μεταφέρθηκε στο πάρκο άγριας ζωής «Terra Natura» (Βόρεια Ανατολική Ισπανία) το 2017. Το πάρκο άγριας ζωής «Terra Natura» βρίσκεται στην περιουριακή περιοχή της πόλης Murcia (38°00′40″N, 1°09′54”O). Το περίβλημα της βίδρας αποτελούνταν από μια περιοχή με καταφύγια ελεύθερης πρόσβασης και μια λίμνη που περιείχε 4 ζώα αυτού του είδους (2 αρσενικά και 2 θηλυκά). Δεν εφαρμόστηκε στα ζώα αντι-μυζητικό εντομοκτόνο. Τον Αύγουστο του 2019 το ζώο παρουσίασε διμερή ρινική αιμορραγία, ανορεξία, απάθεια και απώλεια βάρους (Εικ. ). Το ζώο αναισθητοποιήθηκε πριν από το χειρισμό με μεδετομιδίνη (0,2 mg/kg/i.m.) και κεταμίνη (20 mg/kg/i.m.). Ολόκληρο το αίμα ελήφθη με φλεβοκέντηση από την κεφαλή φλέβα, στραγγίστηκε σε σωλήνα 1 ml επικαλυμμένο με αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA) και σε σωλήνα 1 ml χωρίς αντιπηκτικό για πλήρη καταμέτρηση των κυττάρων του αίματος (CBC) και βιοχημικές αναλύσεις, αντίστοιχα. Η CBC έγινε σε μετρητή κυττάρων αίματος (ADVIA 120 Hematology System, Siemens, Ιταλία), και οι βιοχημικές αναλύσεις έγιναν σε αυτόματο αναλυτή βιοχημείας (Olympus AU600 Automatic Chemistry Analyzer, Olympus Europe GmbH, Αμβούργο, Γερμανία). Επιπλέον, το ούρο ελήφθη με υπερηχογραφικά καθοδηγούμενη κυστεοσκόπηση για ουρηθροσκόπηση. Μια μελέτη υπερηχογραφίας της καρδιάς και των κοιλιακών οργάνων συμπεριλαμβανομένων των νεφρών, της σπλήνας, του ήπατος, της χοληδόχου κύστης, του παγκρέατος και του πεπτικού συστήματος, έγινε. Δεδομένου ότι τα βιοχημικά και υπερηχογραφικά αποτελέσματα ήταν συμβατά με την κλινική λεϊσμανίαση, έγιναν ορολογικές και μοριακές εξετάσεις για να επιβεβαιωθεί η παρουσία της λοίμωξης. Η παρουσία αντισωμάτων IgG2 κατά της λεϊσμανίας αξιολογήθηκε στο ορό της βίδρας με ανοσοφθορομετρική ανάλυση που έγινε με τον τρόπο που περιγράφεται από τους Cantos-Barreda και συν. []. Για να ελεγχθεί ότι η ανοσοφθορομετρική ανάλυση TR-IFMA που είχε επικυρωθεί για τον ορό σκύλου μπορεί να εφαρμοστεί και στον ορό βίδρας, έγινε ανάλυση Western blot. Η Western blot έγινε σε ορούς βίδρας με συμπτώματα συμβατά με τη λεϊσμανίαση και σε ορό σκύλου θετικού για λεϊσμανίαση με ανοσοφθορομετρική ανάλυση TR-IFMA. Οι οροί (αραιωμένοι 1:2000) διαχωρίστηκαν υπό αναγωγικές συνθήκες σε μικροπολυακρυλαμιδικούς πηκτές (0,1% νατριούχο δωδεκυλεστέρα (SDS), 12% πηκτώματος διαχωρισμού και 4% πηκτώματος διαχωρισμού). Οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν ηλεκτροφόρια σε φύλλο νιτριδίου του πυριτίου (Bio-Rad, ΗΠΑ) και τοποθετήθηκαν σε υπόστρωμα ROTI®Lumin (Carl Roth, Γερμανία) για να μπλοκαριστούν για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Το αντισώμα αντι-σκύλου IgG2 (AHP498, Bio-Rad, ΗΠΑ) σε αραίωση 1:1000 χρησιμοποιήθηκε ως το κύριο αντισώμα, ενώ το αντισώμα αντι-προβάτου IgG που είχε αντιδράσει με υπεροξείδιο του ριζικού οξέος (HRP) (SAB3700702, Sigma-Aldrich, ΗΠΑ) σε αραίωση 1:1000 χρησιμοποιήθηκε ως το δευτερεύον αντισώμα για να ανιχνευθεί το δεσμευμένο κύριο αντισώμα. Η ανίχνευση του σήματος έγινε με το κιτ Pierce ECL2 (Pierce, Thermo Fisher Scientific, ΗΠΑ) και ψηφιοποιήθηκε στο σαρωτή Typhoon 9410 (GE Healthcare, ΗΠΑ). Παρατηρήθηκε περίπου 150 kDa ζώνη στο δείγμα βίδρας καθώς και στο δείγμα σκύλου (βλέπε εικόνα και πρόσθετο αρχείο). Τα ευρήματα αυτά επιβεβαίωσαν ότι η ανοσοφθορομετρική ανάλυση TR-IFMA με αντισώματα αντι-σκύλου IgG2 ήταν σε θέση να ανιχνεύσει την IgG2 της βίδρας. Η ανοσοφθορομετρική ανάλυση TR-IFMA αποτελούνταν από μια μη ανταγωνιστική έμμεση μέθοδο που βασίζεται σε βιοτίνη-συνδεδεμένο ανασυνδυασμένο αντιγόνο ως αντιδραστήριο σύλληψης και αντισώματα αντι-σκύλου IgG2 (αντι-σκύλο IgG2, Bio-Rad, ΗΠΑ) ετικεταρισμένα με Eu3+ ως ανιχνευτή. Η δοκιμή περιλάμβανε ορό από άρρωστο σκύλο θετικού για λεϊσμανίαση και ορό από υγιές σκύλο αρνητικό για λεϊσμανίαση ως θετικό μάρτυρα. Η ανάλυση έγινε σε πολυ-ανιχνευτή (VICTOR2 1420, PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Turku, Φινλανδία). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μονάδες φθορομετρίας για τη λεϊσμανίαση (UFL). Το όριο ορίστηκε σε 22 UFL. Επίσης, έγινε ανοσολογική δοκιμασία σύνδεσης με αντισώματα (ELISA) (Leiscan® Leishmania ELISA Test, Esteve Veterinaria, Laboratorios Dr. Esteve SA, Βαρκελώνη, Ισπανία) που ανίχνευε ειδικά αντισώματα IgG κατά της λεϊσμανίασης. Τα δείγματα ορού αραιώθηκαν 1:20 και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως λόγος δείγματος προς θετικό (S/P), υπολογιζόμενα με βάση την οπτική πυκνότητα (OD) δείγματος/OD χαμηλού θετικού μάρτυρα. Τιμές S/P άνω του 1,1 θεωρήθηκαν θετικές. Η παρουσία του DNA του Leishmania spp. σε ολικό αίμα και μυελό των οστών αξιολογήθηκε με την ενίσχυση της αλληλουχίας του DNA του κινητοπλάσματος του Leishmania spp. με χρήση μιας αντίδρασης RT-PCR με εκκινητές και ανιχνευτές που είχαν περιγραφεί προηγουμένως []. Ο μυελός των οστών ελήφθη μέσω αναρρόφησης με λεπτή βελόνα από την κοστοκογχική ένωση και παροχετεύθηκε σε σωλήνα 1 ml επικαλυμμένο με EDTA. Το DNA ελήφθη με χρήση του High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, Γερμανία), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η RT-PCR εκτελέστηκε σε τελικό όγκο 20 μl, συμπεριλαμβανομένου 1× iTaq Universal Probes Supermix (Bio-Rad, CA, ΗΠΑ), 900 nM από κάθε εκκινητή, 200 nM από την ανιχνευτή του κινητοπλάσματος του Leishmania, 1× Exo IPC Mix, 1× Exo IPC DNA και 50 ng DNA από κάθε δείγμα. Οι παράμετροι του κύκλου ήταν: 50 °C για 30 s, 95 °C για 10 min, 45 κύκλοι στους 94 °C για 30 s και 55 °C για 1 min. Κάθε κύκλος ενίσχυσης περιλάμβανε θετικούς και αρνητικούς ελέγχους και κάθε μέτρηση έγινε εις τριπλούν. Για την ταυτοποίηση των ειδών Leishmania, τα προϊόντα PCR από τα θετικά δείγματα καθαρίστηκαν με χρήση του High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, Γερμανία) και υποβλήθηκαν σε αλληλούχιση στο Τμήμα Μοριακής Βιολογίας του Πανεπιστημίου της Μούρθια. Οι αλληλουχίες που ελήφθησαν συγκρίθηκαν με τις διαθέσιμες στο GenBank. Επιπλέον, ως αρνητικός έλεγχος, οι ίδιες αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε μια 3χρονη θηλυκή ευρασιατική ενυδρίδα από το ίδιο πάρκο άγριας ζωής χωρίς κλινικά συμπτώματα συμβατά με λεϊσμανίαση. Όλα τα αποτελέσματα εμφανίζονται στον Πίνακα. Επιβεβαιώθηκε η εμφάνιση λεϊσμανίωσης και χορηγήθηκε ειδική θεραπεία (αλοπουρινόλη 15 mg/kg/24 h/από του στόματος). Η παρακολούθηση της θεραπείας πραγματοποιήθηκε τον Νοέμβριο του 2019, μετά από 3 μήνες θεραπείας. Παρατηρήθηκε διμερής νεφροπάθεια με υδρονεφροπάθεια, μεσεντερική λεμφαδενομεγαλία και ασκίτη. Η γενική αίματος αποκάλυψε μείωση των λευκών αιμοσφαιρίων και μείωση των αιμοπεταλίων στη λεϊσμανίωση θετική βίδρα. Το βιοχημικό προφίλ ορού για τη λεϊσμανίωση θετική βίδρα έδειξε υπερφουσκινισμό, υπεργλοβουλιναιμία, μείωση της PON-1 και αύξηση της απτοσφαιρίνης και της φερριτίνης. Η ανάλυση ούρων αποκάλυψε πρωτεϊνουρία και μείωση της οσμωτικότητας και του ειδικού βάρους. Παρατηρήθηκε η παρουσία αντι-λεϊσμανιακών αντισωμάτων IgG2 και θετικό αποτέλεσμα από την RT-PCR σε ό,τι αφορά το ολικό αίμα και τον μυελό των οστών, για τη λεϊσμανίαση θετική βίδρα. Η αλληλουχία των θετικών δειγμάτων επιβεβαίωσε την ταυτοποίηση του L. infantum. Η ενισχυμένη αλληλουχία παρουσίασε 100% ομοιότητα με μια αναφορά αλληλουχίας του L. infantum. Επιπλέον, παρατηρήθηκαν ωοειδείς μικροοργανισμοί με εκκεντρικό πυρήνα συμβατό με τα αμαστιγότα του Leishmania spp. στην κυτταρολογία του σπλήνα (Εικ.