52χρονη γυναίκα με ιστορικό χολοκυστεκτομής και μερικής εκτομής του αριστερού ηπατικού λοβού το 2004 λόγω συμπτωματικού χολολίθου και πολλαπλών ενδοηπατικών χοληφόρων οδών χολολιθίασης είχε διαλείποντα πυρετό και προοδευτικό ίκτερο από τις αρχές Νοεμβρίου του 2014. Η απόφραξη των χοληφόρων οδών και η υποψία ηπατικής χολικής κακοήθειας ανιχνεύθηκαν μέσω της επόμενης υπερηχογραφίας, μαγνητικής τομογραφίας χολοπαγκρεατογραφίας (MRCP), μαγνητικής τομογραφίας (MRI) και τομογραφίας εκπομπής ποζιτρονίων-τομογραφίας υπολογιστικής τομογραφίας (PET-CT) (Εικόνα S1). Η διερευνητική λαπαροτομία πραγματοποιήθηκε στα τέλη Νοεμβρίου του 2014 (Επιπλέον αρχείο: Εικόνα S1) και διαπιστώθηκε σοβαρή ενδοκοιλιακή συμφόρηση, ένα ογκίδιο (1 × 2 cm) με σκληρή υφή στον εγγύς αριστερό ηπατικό πόρο και διάχυτες νεοπλασματικές βλάβες που διείσδυσαν στο χολικό ήπαρ, το ηπατοδωδεκαδακτυλικό σύνδεσμο, τους γύρω λεμφαδένες, την ηπατική αρτηρία, τη φλεβική πύλη και τον κοιλιακό άξονα. Τα ευρήματα αυτά ανάγκασαν τους χειρουργούς να εγκαταλείψουν την ριζική εκτομή. Το πύον από το χοληφόρο πόρο και το βλεννώδες πώμα προεξείχαν από το τοίχωμα του χοληφόρου πόρου. Μερικές νεοπλασματικές βλάβες αφαιρέθηκαν από τους διευρυμένους λεμφαδένες, τον πυρήνα του αριστερού ηπατικού πόρου και το περιθώριο της κοινής ηπατικής αρτηρίας για παθολογική εξέταση. Το σωλήνα αποχέτευσης χοληφόρων οδών τοποθετήθηκε για ανακούφιση από την χοληφόρο απόφραξη. Οι παθολογικές εκθέσεις αποκάλυψαν ότι η φύση του όγκου ήταν κακοήθης αδενοκαρκίνωμα με δείκτες διαφοροποίησης των χολαγγειοκυττάρων. Επιπλέον, μετρήσιμη έκφραση του EGFR ανιχνεύθηκε σε >90% των καρκινικών κυττάρων. Η ασθενής τελικά διαγνώστηκε ως προχωρημένη μη εγχειρήσιμη περιηληθριακή CCA. Πέντε εβδομάδες μετά την παρηγορητική χειρουργική επέμβαση, η ασθενής έλαβε μια 4 εβδομάδων πορεία θεραπείας με TOMO για την κακοήθη χοληφόρου οδού (DT = 60 Gy/25 F), έναν κύκλο συστηματικής χημειοθεραπείας με αλβουμίνη δεσμευμένη μόνο για τις μη ανεκτές γαστρεντερικές τοξικότητες και την έγχυση των κυττάρων δολοφόνων που προκαλούνται από κυτταροκίνες. Λόγω της προοδευτικής αύξησης του CA199, η PET-CT επανεξετάστηκε αμέσως μετά την ολοκλήρωση της ακτινοθεραπείας και έδειξε μια νέα μεταστατική υπερμεταβολική βλάβη στο δεξιό ηπατικό λοβό και διευρυμένα μαλακά μόρια και μεταστάσεις του ήπατος με μη φυσιολογική τυπική πρόσληψη (SUV) μεταξύ του ήπατος και του στομάχου σε σύγκριση με την PET-CT πριν από την ακτινοθεραπεία (Εικόνα S1). Τέσσερις εβδομάδες μετά την ακτινοθεραπεία, η ασθενής εγγράφηκε στη δοκιμή CART-EGFR. Η κατάσταση απόδοσης της ήταν 1 σύμφωνα με τα κριτήρια της Ανατολικής Συνεργασίας Ογκολογικής Ομάδας (ECOG). Κατά την προετοιμασία των κυττάρων CART-EGFR, η ασθενής ανέπτυξε υψηλό πυρετό, επιθετική ίκτερο και απόφραξη των χοληφόρων οδών, συνοδευόμενη από συνεχή αύξηση του CA199 (από 100,5 έως 413,5 U/ml), επιθετική αύξηση της ολικής χολερυθρίνης, άμεσης χολερυθρίνης και άλλων ενζύμων που σχετίζονται με την απόφραξη των χοληφόρων οδών και αντιμετωπίστηκε με αποτελεσματικά ευρέος φάσματος αντιβιοτικά και ενδοσκοπική τοποθέτηση του χοληφόρου οδού στα ηπατικά χοληφόρα. Οι δοκιμές (αναγνωριστικό ClinicalTrials.gov NCT01869166, NCT02541370) εγκρίθηκαν από το θεσμικό συμβούλιο αναθεώρησης στο Γενικό Νοσοκομείο του Κινεζικού Λαϊκού Απελευθερωτικού Στρατού. Δεν συμμετείχε εμπορικός χορηγός στις μελέτες. Οι εγγεγραμμένοι ασθενείς έδωσαν γραπτή συγκατάθεση σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Η αλληλουχία DNA του μεταβλητού τμήματος του μονοκλωνικού αντισώματος (scFv) που στοχεύει το αντιγόνο EGFR προέρχεται από το JQ306330.1 (αριθμός GenBank). Δημιουργήθηκε και κλωνοποιήθηκε στο βασικό λεντοϊρικό γονιδίωμα το CAR scFv-CD137-CD3zeta και περιγράφεται λεπτομερώς από τους Feng et al. []. Το μόριο κατασκευάστηκε και επαληθεύτηκε με αλληλουχία DNA. Παράχθηκε ψευδοτυπημένος κλινικός βαθμού λεντοϊρικός ιός υπερκειμένου με μεταβατική μεταμόσχευση όπως περιγράφεται από τους McGinley et al. [ ] Σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή του αντιδραστηρίου μεταμόσχευσης Lipofectamine 3000 (Invitrogen, ΗΠΑ), το πλασμίδιο pWPT-anti-EGFR CAR, το πλασμίδιο συσκευασίας ps-PAX2 και το πλασμίδιο φακέλου pMD2.G μεταμοσχεύτηκαν σε κύτταρα 293 T. Τα λεντοϊρικά υπερκείμενα συλλέχθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 °C. Το μόριο GFP-CD137-CD3zeta κατασκευάστηκε για να επαληθευτεί η αποτελεσματικότητα της μετάδοσης με κυτταρομετρία ροής FACSCalibur (BD Biosciences). Η αλληλουχία DNA του scFv που στοχεύει το αντιγόνο CD133 προέρχεται από το HW350341.1 (αριθμός GenBank), η παραγωγή, κατασκευή και δοκιμή των Τ κυττάρων CART-EGFR ακολούθησε την ίδια διαδικασία με τα Τ κύτταρα CART-EGFR (Συμπληρωματικό αρχείο: Σχήμα S2). Τα κύτταρα CART κατασκευάστηκαν από αυτόλογα μονοκλωνικά κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) που συλλέχθηκαν σε σωλήνες προετοιμασίας κυττάρων (BD Biosciences, Σαν Χοσέ, Καλιφόρνια) και καθαρίστηκαν από 80 έως 100 ml ολικού αίματος στο Κινεζικό Γενικό Νοσοκομείο PLA Good Manufacturing Practice Facility σύμφωνα με τις τρέχουσες πρότυπες διαδικασίες λειτουργίας. Τα PBMCs διεγέρθηκαν με 50 ng/ml αντι-CD3 MoAb (Takara, Ιαπωνία) και 500 U/ml ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ιντερλευκίνης-2 (Peprotech, ΗΠΑ) σε μέσο GT-T551 (Takara). Η μεταγωγή με λεντοϊό πραγματοποιήθηκε σε μέσο GT-T551 με προταμίνη σουλφάτη (Sigma) για 24 ώρες μετά από 2 ημέρες καλλιέργειας Τ κυττάρων. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επεκτάθηκαν περαιτέρω σε σάκους καλλιέργειας (Takara) και συγκομίστηκαν ως κύτταρα CART. Τα βακτήρια, οι μύκητες και η ενδοτοξίνη ελέγχθηκαν πριν από την έγχυση των κυττάρων CART. Ο ανοσοφαινοτύπος των κυττάρων αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής με φθορίζοντα αντισώματα ειδικά για τη χρώση CD3, CD4, CD8, CD45RO, CD62L και CCR7. Χρησιμοποιήθηκαν μονοκλωνικά αντισώματα ισοτύπων (BD Biosciences) για τον έλεγχο της χρώσης. Εκτιμήθηκε η έκφραση του CAR με βάση τα CD137-CD3zeta-μετασχηματισμένα κύτταρα στην ίδια παρτίδα για όλους τους ασθενείς με κυτταρομετρία ροής. Η συλλογή και ανάλυση δεδομένων έγινε με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής FACSCalibur (BD Biosciences). Η in vitro κυτταροτοξικότητα των κυττάρων CART-EGFR ελέγχθηκε με συγκαλλιέργεια με EGFR-θετικά κύτταρα όγκου σε διάφορες αναλογίες επιδραστικού παράγοντα προς στόχο σε πλάκες 96-πορτών με τη χρήση κιτ ανίχνευσης CCK-8 4 ωρών (DOJINDO, Ιαπωνία). Η ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (Q-PCR) χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί το επίπεδο του γονιδίου σύντηξης CAR σύμφωνα με ένα προηγουμένως περιγραφόμενο πρωτόκολλο.13 Ένα 153-μπωτ (μπωτ βάσης) τμήμα που περιέχει τμήματα της αλυσίδας CD8α και της γειτονικής αλυσίδας 4-1BB (ο εμπρόσθιος εκκινητής 5′-GGTCCTTCTCCTGTCACTGGTT-3′ και ο αντίστροφος εκκινητής 5′-TCTTCTTCTTCTGGAAATCGGCAG-3′) ενισχύθηκε από το σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems). Η βήτα-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό σημείο ελέγχου. Μια τυπική καμπύλη 7 σημείων που αποτελούνταν από 100 έως 108 αντίγραφα/μl πλασμιδίου DNA που περιείχε το γονίδιο CAR παρασκευάστηκε. Ο ορός IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-12/IL23p40, IFN-γ, TNF-α, VEGF, και το γκρανζμπερι Β ελέγχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ανοσοδοκιμασία τύπου μίκρο-σφαιρίσματος της BD Biosciences σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σύμφωνα με το σύστημα καλλιέργειας που αναφέρθηκε προηγουμένως [], τα κύτταρα CART-EGFR δημιουργήθηκαν από τα μονοπύρηνα κύτταρα των 80-100 ml του περιφερικού αίματος του ασθενούς και απελευθερώθηκαν για τις εγχύσεις. Από τα κύτταρα που εγχύθηκαν κατά τον πρώτο κύκλο της θεραπείας CART-EGFR, το 99,14% ήταν κύτταρα CD3+ που αποτελούνταν κυρίως από το υποσύνολο CD8+ (62,26%), και το 23,61% χαρακτηρίστηκαν με το κεντρικό φαινότυπο μνήμης (CD45RO+/CD62L+/CCR7+). Επιπλέον, το 8,99% των εγχυθέντων κυττάρων ήταν θετικά για το EGFR. Το φαινότυπο και η αποτελεσματικότητα της έγχυσης των κυττάρων CART-EGFR σε κάθε κύκλο τεκμηριώνονται στον Πίνακα. Τα κύτταρα CART133 δημιουργήθηκαν και καλλιεργήθηκαν σύμφωνα με την ίδια διαδικασία με τα κύτταρα CART-EGFR. Από τα εγχυμένα κύτταρα, το 95,2% ήταν κύτταρα CD3+ που αποτελούνταν κυρίως από το υποσύνολο CD8+ (71,9%), και το 41,9% ήταν το υποσύνολο CD45RO+/CD62L+/CCR7+. Επιπλέον, το 6,4% των εγχυμένων κυττάρων ήταν θετικά για το CD133. Οι λεπτομέρειες τεκμηριώνονται στον Πίνακα. Λόγω της πρόσφατης ολοκλήρωσης της ακτινοθεραπείας εντός 2 μηνών και της δυσανεξίας των χημειοθεραπευτικών παραγόντων, η ασθενής έλαβε 4-ήμερες διαδοχικές εγχύσεις 2,2 × 106/kg CART-EGFR κυττάρων συνολικά χωρίς καμία προθεραπεία και πέτυχε μια PR στην πρώτη αξιολόγηση 6 εβδομάδες αργότερα, η οποία αξιολογήθηκε σύμφωνα με τα κριτήρια αξιολόγησης ανταπόκρισης σε συμπαγείς όγκους έκδοση 1.1 (RECIST 1.1) με μαγνητική τομογραφία και τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων (PET-CT), η οποία έδειξε μια συρρίκνωση των μεταστατικών αλλοιώσεων στην περιοχή του ηπατικού πυλωρού και του κερκοφόρου λοβού μεγαλύτερη από 80% και μια αξιοσημείωτη μείωση του SUV (Εικ. ), μαζί με μια ταχεία μείωση του CA199 από 413,5 σε 123,1 U/ml (Εικ. ). Ο αριθμός αντιγράφων του μεταγονιδίου CAR στο περιφερικό αίμα της ασθενούς έφθασε σε μέγιστο αριθμό 5916 pg/dl την 9η ημέρα συνοδευόμενο με απελευθέρωση κυτοκινών όπως η ιντερλευκίνη-6 (IL-6) και η αντιδραστική πρωτεΐνη (CRP) (Εικ. και ). Ο δεύτερος κύκλος μονοθεραπείας με CART-EGFR μεταγονιδίων έλαβε χώρα με δόση Τ-κυττάρων που εκφράζουν EGFR-CAR+ 2,1 × 106/kg και χωρίς οποιαδήποτε προθεραπεία επειδή ο αριθμός αντιγράφων του μεταγονιδίου CAR στο περιφερικό αίμα μειώθηκε κοντά στο επίπεδο αναφοράς 2 μήνες μετά την πρώτη έγχυση γενετικά τροποποιημένων Τ-κυττάρων που εκφράζουν CART-EGFR. Οι συνήθεις εξετάσεις μαγνητικής τομογραφίας και τομογραφίας εκπομπής ποζιτρονίων (PET-CT) έδειξαν μια σταθερή PR συνοδευόμενη με μια περαιτέρω μείωση του CA199 σε 61,2 U/ml (Εικ. και ). Είναι ενδιαφέρον ότι η κορυφή του αριθμού αντιγράφων του μεταγονιδίου CAR μετά τη δεύτερη έγχυση κυττάρων CART-EGFR δεν έφθασε σε αντίστοιχο ή υψηλότερο επίπεδο όπως η πρώτη έγχυση της θεραπείας CART-EGFR (Εικ. ). Η κατάσταση PR της ασθενούς διατηρήθηκε για 8,5 μήνες έως ότου ανέπτυξε συχνό ανεξέλεγκτο εμετό, ανώδυνο κοιλιακό άλγος και γαστρικό οισοφαγικό reflux, το οποίο συνέβη στα μέσα Νοεμβρίου του 2015. Η επακόλουθη ηλεκτρονική γαστροσκόπηση έδειξε στένωση του δωδεκαδακτύλου και το PET-CT επιβεβαίωσε την εξέλιξη του όγκου με απεικόνιση πολλαπλών νέων μη φυσιολογικών αλλοιώσεων SUV στην omentum majus, το περιτόναιο και την κοιλιακή κοιλότητα (Εικ. ). Μετά από αυτό, η ασθενής έλαβε θεραπεία με 1 κύκλο CART-EGFR σε συνδυασμό με 2 κύκλους μονοκλωνικού αντισώματος κατά της πρωτεΐνης 1 του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου (Nivolumab, Bristol-Myers Squibb), το οποίο χορηγήθηκε σε δόση 100 mg κάθε 2 εβδομάδες. Ομοίως, ο αριθμός αντιγράφων του μεταγονιδίου CAR που παρακολουθούνταν στο περιφερικό αίμα δεν έφθασε σε παρόμοιο επίπεδο κορυφής με την έγχυση του πρώτου κύκλου, ακόμη και σε συνδυασμό με το αντίσωμα κατά του PD-1 (Εικ. ). Παρά το γεγονός ότι ο ορός CA199 μειώθηκε παροδικά από 326,3 σε 210,8 U/ml (Εικ. ), η επόμενη τομογραφία PET-CT εντόπισε νεοεμφανιζόμενες μεταστάσεις στο κάτω μέρος της πυέλου, το δεξιό λοβό του ήπατος και τον αριστερό υπερκλειδοβιακό λεμφαδένα, καθώς και διεύρυνση προηγούμενων αλλοιώσεων του όγκου στην κοιλιά σε σύγκριση με την τομογραφία PET-CT πριν από την συνδυασμένη ανοσοθεραπεία (Εικ. και Εικ.). Επειδή πάνω από το 90% των καρκινικών κυττάρων εξέφραζαν την πρωτεΐνη CD133 (πρόσθετο αρχείο: Σχήμα S3), η ασθενής εντάχθηκε στη μελέτη CART133 και έλαβε την έγχυση 1,22 × 106/kg CD133-ειδικών CART κυττάρων χωρίς προπαρασκευαστική θεραπεία. Επειδή εμφανίστηκε απόφραξη στο κατιόν του δωδεκαδάκτυλου και η επακόλουθη επίμονη σοβαρή λοίμωξη των χοληφόρων οδών καθώς και το απόστημα του ήπατος, που ενδέχεται να επηρεάσει το επίπεδο του CA199 στον ορό και αντιμετωπίστηκε με αντιβιοτικά, η προγραμματισμένη αξιολόγηση απεικόνισης αναβλήθηκε για 2 μήνες μετά την έγχυση των CART133 κυττάρων, όπου η CT με ενίσχυση αντίθεσης έδειξε αξιοσημείωτη συρρίκνωση ή ακόμα και εξαφάνιση μερικών μεταστάσεων στο περιτόναιο και την κοιλιακή κοιλότητα, οδηγώντας σε αξιολόγηση της PR (Σχ.). Ο αριθμός αντιγράφων του μεταγονιδίου CAR στο περιφερικό αίμα (PB) κυμαινόταν από 377 έως 919 pg/dl (Σχ.). Η ασθενής ένιωσε επίμονο θαμπό πόνο στο άνω μέρος της κοιλιάς 2,5 μήνες αργότερα και η επακόλουθη CT σάρωση εντόπισε μια νέα μεταστατική βλάβη περίπου 40 × 70 mm κάτω από το κοιλιακό τοίχωμα και ύποπτες μεταστάσεις στην κοιλιακή κοιλότητα συνοδευόμενες από μείωση του αριθμού αντιγράφων του μεταγονιδίου CAR στο PB κοντά στο επίπεδο της βασικής γραμμής, οδηγώντας σε συμπέρασμα για προοδευτική νόσο (PD) (Σχ.). Αντενδείξεις όπως ρίγη, πυρετός, κόπωση, εμετός και μυαλγία που εμφανίστηκαν κατά τη διάρκεια της έγχυσης των κυττάρων CART-EGFR ήταν συνήθως ήπιες, ανεκτές και αντιμετωπίσιμες με υποστηρικτική φροντίδα. Ωστόσο, η ασθενής ανέπτυξε πυρετό που διήρκεσε 9 ημέρες χωρίς ρίγη, βήχα, διάρροια ή άλλα λοιμώδη συμπτώματα από την τρίτη ημέρα μετά την έγχυση των κυττάρων CART. Επαναλαμβανόμενη εργαστηριακή εξέταση του περιφερικού αίματος έδειξε φυσιολογικό αριθμό λευκών αιμοσφαιρίων, αναλογία ουδετερόφιλων, αρνητική προκαλιτονίνη (PCT) και καλλιέργειες αίματος, που δεν υποστήριζαν τη διάγνωση λοίμωξης, αλλά εν τω μεταξύ υπήρχε κλιμάκωση της IL-6 και CRP (Εικ. ) και οξεία αύξηση της γλουταμινικής-πυρουβικής τρανσαμινάσης και της γλουταμινικής-οξαλοξικής τρανσαμινάσης (>6ULN). Εμφανίστηκαν μερικές διάσπαρτες μικροσκοπικές εξανθήσεις στο αριστερό μηρό 2 εβδομάδες μετά την έγχυση του πρώτου κύκλου των κυττάρων CART-EGFR, οι οποίες σταδιακά χειροτέρευσαν και έγιναν εμφανείς και κνησμώδεις με την εμφάνιση πολλαπλών φολιδωτών ή γραμμικών εξανθημάτων που εξαπλώνονταν από το αριστερό μηρό στο γάμπα και συγχωνεύονταν μεταξύ τους, που βαθμολογήθηκε 2 σύμφωνα με τα κοινά κριτήρια ορολογίας για ανεπιθύμητες ενέργειες 4.0 (CTCAE 4.0), όταν ολοκληρώθηκε ο δεύτερος κύκλος της ανοσοθεραπείας CART. Τα εξανθήματα υποβλήθηκαν σε βιοψία με απεικόνιση παθολογικών αλλαγών τύπου λειχήνων όπως η απώλεια μερικού επιδερμικού ιστού, η κενοτοπιώδης εκφύλιση των βασικών κυττάρων και η διήθηση πολλών Τ λεμφοκυττάρων στην επιδερμίδα και τα παραρτήματά της (Εικ. ), και αντιμετωπίστηκαν με επιτυχία με αλοιφή τακρόλιμους. Δεν παρατηρήθηκε υπόταση καθ' όλη τη διάρκεια της θεραπείας με CART-EGFR. Εκτός από ήπια ναυτία, εμετό, ρίγη, πυρετό και κόπωση, δεν υπήρξαν άλλες οξείες ανεπιθύμητες ενέργειες κατά τη διάρκεια της συνδυασμένης θεραπείας. Αν και εμφανίστηκε και επιδεινώθηκε η πιτυρίδα μετά τη συνδυασμένη ανοσοθεραπεία, δεν χρειάστηκε ιατρική παρέμβαση. Τα επίπεδα των κυτοκινών στον ορό, όπως ο παράγοντας νέκρωσης όγκων α (TNF-α), η IL-6 και η CRP, αυξήθηκαν ελαφρά και δεν προκάλεσαν συμπτώματα απελευθέρωσης κυτοκινών. Κατά τη διάρκεια της έγχυσης των κυττάρων CART133 που κλιμακώνονται σε δόσεις για 4 ημέρες, δεν υπήρξαν άλλες ανεπιθύμητες ενέργειες εκτός από τον πυρετό και την κόπωση που σχετίζονται με την έγχυση. Ωστόσο, το δεύτερο πρωί μετά την ολοκλήρωση της έγχυσης των κυττάρων CART133, η ασθενής ανέπτυξε διαλείποντες ανώτερους κοιλιακούς πόνους, ρίγη, πυρετό (39,1 °C), σποραδικές μικροσκοπικές αιμορραγίες και οίδημα του δέρματος στα πόδια της, το οποίο εξαπλώθηκε γρήγορα και διάχυτα στο λαιμό, το δεξιό άνω βραχίονα, το στήθος, το αριστερό κοιλιακό τοίχωμα και το οπισθοφαρυγγικό βλεννογόνο, συνοδευόμενο από κνησμό και διάρροια το απόγευμα και επιδεινώθηκε περαιτέρω τις επόμενες 10 ημέρες (Εικ.). Οι ανεπιθύμητες ενέργειες του δέρματος και του υποδόριου ιστού βαθμολογήθηκαν 3 σύμφωνα με το CTCAE 4.0. Οι εξετάσεις των κυτταροκινών του ορού σε διαδοχικές δόσεις ανίχνευσαν την ταχεία αύξηση των ΤΝF-α, IL-6 και CRP (Εικ.). Η ετανερσέπτη, μια πρωτεΐνη σύντηξης που δρα ως αναστολέας του ΤΝF, η ενδοφλέβια μεθυλοπρεδνιζολόνη και η γ-σφαιρίνη χορηγήθηκαν αμέσως και ανέστρεψαν επιτυχώς τις τοξικές επιδράσεις στο δέρμα/ βλεννογόνο. Η χρήση Τ κυττάρων τροποποιημένων με CAR για την εξάλειψη καρκίνων έχει μελετηθεί για περισσότερα από 20 χρόνια, μέχρι πρόσφατα, όταν η CART19 παρήγαγε πολλά υποσχόμενα αποτελέσματα σε αιματολογικές κακοήθειες που εκφράζουν το CD19. Ωστόσο, το πώς θα μεταφραστεί αυτή η συναρπαστική επιτυχία της θεραπείας CART σε συμπαγείς όγκους παρέμεινε ασαφές, απαιτώντας καλύτερη κατανόηση των πιθανών θεραπευτικών εμποδίων, συμπεριλαμβανομένων των παραγόντων που ρυθμίζουν την επέκταση των Τ κυττάρων CART, την εμμονή και την κυκλοφορία τους in vivo, το μικροπεριβάλλον του όγκου και την αλληλεπίδρασή του με τα καρκινικά κύτταρα, καθώς και τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα, καθώς και τις θεραπείες προετοιμασίας. Όπως επεσήμαναν οι Porter και συν., η έντονη επέκταση και η διατήρηση των κυττάρων CART in vivo είναι κρίσιμος παράγοντας της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας [], στην περίπτωση αυτή, ο αριθμός αντιγράφων του μεταγονιδίου CAR στο PB αυξήθηκε σε μέγιστο επίπεδο αμέσως μετά την έναρξη της έγχυσης των κυττάρων CART-EGFR, γεγονός που καταδεικνύει ότι τα κύτταρα CART-EGFR υποβλήθηκαν σε έντονη επέκταση in vivo, η οποία αποτελεί μία από τις προϋποθέσεις για την εξάλειψη των κυττάρων CCA που εκφράζουν το EGFR από τα κύτταρα CART-EGFR. Επιπλέον, η διατήρηση των κυττάρων CART in vivo, παρά τους διάφορους πιθανούς παράγοντες παρεμβολής, όπως η συγγένεια του CAR με τον στόχο, η ανοσογονικότητα του CAR και οι παράγοντες που προέρχονται από τον ξενιστή, έχει αποδειχθεί ότι σχετίζεται άμεσα με τον μεγαλύτερο χρόνο έως την εξέλιξη [] Ο συγκεκριμένος ασθενής έλαβε την έγχυση του δεύτερου κύκλου των κυττάρων CART-EGFR αμέσως μόλις ο αριθμός αντιγράφων του μεταγονιδίου CAR στο PB μειώθηκε κοντά στο επίπεδο της βασικής γραμμής 8 εβδομάδες μετά την έγχυση του πρώτου κύκλου, γεγονός που επέτρεψε στα κύτταρα CART να διατηρηθούν αποτελεσματικά in vivo για περισσότερο από 24 εβδομάδες και η κατάσταση του PR του ασθενούς να διατηρηθεί για 8,5 μήνες, γεγονός που ενδέχεται να υποδηλώνει ότι οι επαναλαμβανόμενες εγχύσεις των κυττάρων CART θα μπορούσαν να συμβάλουν στην παράταση της διατήρησης της in vivo και στην παράταση της επιβίωσης χωρίς εξέλιξη σε συνθήκες όπου ο στοχευόμενος όγκος ανταποκρίθηκε στα κύτταρα CART-EGFR. Εν τω μεταξύ, διαπιστώσαμε ότι οι αριθμοί αντιγράφων του μεταγονιδίου CAR των επόμενων κύκλων έγχυσης των κυττάρων CART δεν μπορούσαν να φτάσουν σε παράλληλο ή υψηλότερο μέγιστο, ακόμη και σε συνδυασμό με το αντίσωμα anti-PD-1, σε σύγκριση με τον πρώτο κύκλο, γεγονός που καταδεικνύει την εξασθένηση της επέκτασης των κυττάρων CART in vivo και την απώλεια των κυττάρων CART. Ένας πιθανός μηχανισμός είναι ότι το scFv που ενσωματώθηκε στο μεταγονιδίωμα CAR μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη ανοσοποιητικής απόκρισης των Τ κυττάρων CD8+ [] Η απόλυτη λειτουργική ικανότητα των κυττάρων CART σε συμπαγείς όγκους καθορίζεται από το αν μπορούν να διεισδύσουν αποτελεσματικά στο μικροπεριβάλλον του όγκου, ένα σύνθετο και πυκνό δίκτυο ινωδών ιστών που συντονίζεται από κακοήθεις και μη κακοήθεις κυτταρικές μορφές, στο οποίο τα διεισδυμένα κύτταρα CART μπορούν να αναχαιτιστούν από ανοσοκατασταλτικά κύτταρα και μόρια όπως τα Τregs, τα κατασταλτικά κύτταρα που προέρχονται από μυελό (MDSCs) και το πρόγραμμα θανάτου των κυττάρων (PD-L1) [,], με αποτέλεσμα την ταχεία απώλεια της ικανότητας κυτταρολυτικής και κυτταροκίνης έκκρισης και την είσοδο σε κατάσταση υποαντιδραστικότητας []. Επιπλέον, οι συμπαγείς όγκοι συχνά παρουσιάζουν μεταβολικές ανωμαλίες λόγω της υπερκατανάλωσης βασικών αμινοξέων που είναι κρίσιμα για τη δραστηριότητα των Τ κυττάρων και προκαλούν υποξία και επακόλουθη όξινιση του εξωκυτταρικού μήκους λόγω ανεπαρκούς παροχής από τα αγγεία, που είναι εχθρική προς την επιβίωση των Τ κυττάρων [] Έτσι, η ρύθμιση του μικροπεριβάλλοντος του όγκου είναι απαραίτητη για τη βελτίωση των αποτελεσμάτων. Στην περίπτωση αυτή, παρά το γεγονός ότι η ασθενής δεν έλαβε άμεση θεραπεία προετοιμασίας με σκοπό τη μετατροπή του μικροπεριβάλλοντος του όγκου, έλαβε θεραπεία με ακτινοθεραπεία 60 Gy πριν από την ανοσοθεραπεία με μεσοδιάστημα περίπου ενός μήνα από το τέλος της ακτινοθεραπείας έως την αρχή της έγχυσης των κυττάρων CART. Αν και η ακτινοθεραπεία από μόνη της απέτυχε να εξαλείψει αποτελεσματικά τα καρκινικά κύτταρα, η άμεση και καθυστερημένη επίδρασή της μπορεί να διαδραματίσει ρόλο στην καταστροφή του υποστηρικτικού στρώματος του όγκου, μεταβάλλοντας τη βιολογία του μικροπεριβάλλοντος του όγκου, προωθώντας την απελευθέρωση περισσότερων αντιγόνων που σχετίζονται με τον όγκο και ενισχύοντας την ανοσολογική αναγνώριση [] Επιπλέον, η ακτινοθεραπεία μπορεί να κάνει τους όγκους πιο ανοσογονικούς και πιο ευαίσθητους σε μια βελτιωμένη επίθεση από τα ανοσοκύτταρα [], και μπορεί ακόμη και να δημιουργήσει αντικαρκινικά αποτελέσματα σε απομακρυσμένες μεταστάσεις που δεν είχαν ακτινοβοληθεί τοπικά (αναφέρεται ως το απόηχο του αντικαρκινικού αποτελέσματος) [, ]. Έτσι, θέτουμε την υπόθεση ότι η ακτινοθεραπεία μπορεί να είναι μια λογική και αποτελεσματική θεραπεία προετοιμασίας για τη βελτίωση του αποτελέσματος της θεραπείας με CART. Όταν επιβεβαιώθηκε η αντίσταση στη θεραπεία CART-EGFR, δοκιμάσαμε μια φορά μια ανοσοθεραπεία συνδυασμού με αντι-PD-1 αντίσωμα σε συνδυασμό με έγχυση κυττάρων CART-EGFR με βάση μια προκλινική μελέτη ότι ο αποκλεισμός της ανοσοκαταστολής PD-1 θα μπορούσε να ενισχύσει σημαντικά την θεραπευτική αποτελεσματικότητα της θεραπείας με κύτταρα CART κατά των καθιερωμένων συμπαγών όγκων []. Δυστυχώς, αυτή η θεραπεία κατέληξε σε αποτυχία με την PET-CT να επιβεβαιώνει την εξέλιξη της νόσου, αν και το CA199 μειώθηκε παροδικά. Μια πιθανή εξήγηση είναι το ασαφές επίπεδο έκφρασης του PD-L1. Πρόσφατα, η έκφραση του PD-L1 επισημαίνεται για την αξία της στην πρόβλεψη των θεραπευτικών αποτελεσμάτων των αντι-PD-1 φαρμάκων. Ωστόσο, η βλάβη του όγκου σε αυτή την περίπτωση ήταν δύσκολη για βιοψία λόγω της ανατομικής θέσης της, με αποτέλεσμα το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης PD-L1 στα κύτταρα του όγκου να μην μπορεί να ανιχνευθεί με ακρίβεια πριν από την έναρξη της θεραπείας με αντι-PD-1, η οποία αποτελεί πιθανότητα ότι η έκφραση του PD-L1 στο περιβάλλον του όγκου θα μπορούσε να είναι χαμηλού επιπέδου ή ακόμη και αρνητική και ως εκ τούτου θα οδηγούσε σε αποτυχία της θεραπείας με αντι-PD-1. Εν τω μεταξύ, υπήρχαν πολλές άλλες παράλληλες οδοί ελέγχου σημείων που θα μπορούσαν ενδεχομένως να υποστηρίξουν την αντίσταση στη θεραπεία αντι-PD-1 [ ] Σύμφωνα με αυτή την κατάσταση, η επιλογή ενός ορθολογικού στόχου ήταν κρίσιμη για το επόμενο βήμα της θεραπείας των ασθενών. Πρόσφατα, τα CSCs στο CCA έχουν προσελκύσει μεγάλη προσοχή για τις υψηλές καρκινογόνες ιδιότητές τους και τους βασικούς ρόλους τους στη διαμεσολάβηση της αυτοανανέωσης, της επανεμφάνισης του όγκου και της θεραπευτικής αντίστασης, συνεπώς, η θεραπεία που στοχεύει σε επιφανειακούς μοριακούς δείκτες και οδούς σηματοδότησης ειδικά για τα CSC θα ήταν μια πιθανή ισχυρή επιλογή για το CCA [, ]. Μεταξύ των μορίων που χρησιμοποιούνται μεμονωμένα ή σε συνδυασμό για τον προσδιορισμό των βλαστοκυττάρων χολαγγειοκαρκινώματος, το CD133 είναι ένα από τα σημαντικότερα βλαστοκυτταρικά δείγματα που συνδέονται με υψηλότερη διεισδυτικότητα και φτωχότερη πρόγνωση [ ] Οι Shien και οι συνεργάτες του ανέφεραν επίσης ότι τα κύτταρα όγκου CD133-θετικά έδειξαν μεγαλύτερη αντίσταση στη μετα-χειρουργική θεραπεία από τα κύτταρα CD133 αρνητικά και παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση του CD133 σε καρκινικά κύτταρα μετά από θεραπεία με ανοσοκατασταλτικά [ ] Με βάση τα παραπάνω, επιλέξαμε τελικά το CD133 ως στόχο αντιγόνου για ανοσοθεραπεία CART, η οποία με τη σειρά της παρήγαγε μια άλλη μερική ανταπόκριση και κατέδειξε περαιτέρω ότι η ανοσοθεραπεία με κοκτέιλ CART μπορεί να είναι εφικτή και ορθολογική. Ένα άλλο κρίσιμο ζήτημα που προκάλεσε μεγάλη ανησυχία ήταν η τοξικότητα, η οποία θα μπορούσε να προκληθεί από τα κύτταρα CART στα στοχευόμενα αντιγόνα που εκφράζονται σε όγκους και/ή συγχρόνως σε φυσιολογικούς ιστούς, που ονομάζεται ως επίδραση εκτός του όγκου σε στοχευόμενα αντιγόνα. Η βλάβη σε φυσιολογικούς ιστούς μπορεί να συμβεί ακόμη και από απροσδόκητη διασταυρούμενη αντίδραση με μια πρωτεΐνη που δεν εκφράζεται σε κύτταρα όγκων [] Από την έναρξη της έγχυσης κυττάρων CART-EGFR, αυτή η ασθενής εμφάνισε όχι μόνο πυρεξία, ρίγη και κόπωση που σχετίζονται με την έγχυση, αλλά και παρατεταμένη πυρεξία, οξεία αύξηση των τρανσαμινών του ορού και καθυστερημένη εμφάνιση δερματικών εξανθημάτων, που συνοδεύονταν από ισχυρή αύξηση του αριθμού αντιγράφων του μεταγονιδίου CAR, της IL-6 και της CRP, αν και τα επίπεδα τους δεν πληρούσαν τα κριτήρια διάγνωσης συνδρόμου απελευθέρωσης κυτοκινών [, ]. Οι μαζικές κυτοκίνες που θα μπορούσαν να παραχθούν άμεσα από τα εγχυμένα κύτταρα CART αντανακλούσαν μια ισχυρή ανοσολογική απόκριση που θα μπορούσε να προκαλέσει τόσο αντικαρκινικές επιδράσεις σε κύτταρα όγκων όσο και παρενέργειες σε φυσιολογικούς ιστούς. Επιπλέον, η επίδραση εκτός του όγκου που προκαλείται από τα κύτταρα CART-EGFR ήταν πιθανώς ο λόγος για την ενεργοποίηση δερματικών τοξικοτήτων λόγω της κατανομής του EGFR στην επιδερμίδα [] Ωστόσο, όλα αυτά τα ανεπιθύμητα συμβάντα ήταν ήπια, αναστρέψιμα και αντιμετωπίστηκαν με υποστηρικτική φροντίδα και τοπικό κορτικοστεροειδές. Η προσθήκη αντι-PD-1 αντισώματος δεν προκάλεσε προφανώς επιδείνωση των τοξικοτήτων της ανοσοθεραπείας με CART-EGFR σε αυτή την περίπτωση. Ωστόσο, στην επακόλουθη θεραπεία με έγχυση κυττάρων CART133, αυτή η ασθενής εμφάνισε σοβαρές δερματικές, στοματικές βλεννογόνες και γαστρεντερικές τοξικότητες όπως οίδημα εξανθήματος και αιμορραγία. Παρόλο που αυτές οι τοξικότητες αντιμετωπίστηκαν επιτυχώς με επείγοντα ιατρικά μέτρα που περιλάμβαναν ενδοφλέβια μεθυλοπρεδνιζολόνη και αναστολέα του TNF, ο εγγενής μηχανισμός μπορεί να οφείλεται σε μεγάλο βαθμό στην επίδραση εκτός του όγκου των κυττάρων CART133 που στοχεύουν στο αντιγόνο CD133 που εκφράζεται σε φυσιολογικό επιθήλιο και αγγειακό ενδοθήλιο. Εν τω μεταξύ, δεν ήταν σαφές αν το αντι-PD-1 αντισώμα και τα εναπομείναντα κύτταρα CART-EGFR in vivo θα μπορούσαν να διαδραματίσουν ρόλο στην επιδείνωση των τοξικοτήτων της ανοσοθεραπείας με CART133.