Ο ασθενής ήταν 22χρονος άνδρας με Β-ΟΛΛ που είχε υποτροπή της οστικής μυελοβλάστης πριν την ένταξή του στο κλινικό μας πρωτόκολλο με χρήση Τ-ΚΑΡ 19 κυττάρων. Διαγνώστηκε με Β-ΟΛΛ με πάνω από 100 × 109/L WBC μέτρηση και φυσιολογικό καρυότυπο τον Ιανουάριο του 2016. Μετά την πλήρη ύφεση (CR) 2, υποβλήθηκε σε αχλο-ΣΣΣ από τον πατέρα του 10 μήνες μετά την αρχική διάγνωση. Είχε υποφέρει από αιμορραγική κυστίτιδα και οξεία ΓΧΓΜ 1ου σταδίου εντός 2 μηνών μετά την αχλο-ΣΣΣ, η οποία υποχώρησε με 15 ημερήσιες δόσεις μεθυλοπρεδνιζολόνης 50 mg ακολουθούμενες από 5 ημερήσιες δόσεις μεθυλοπρεδνιζολόνης 100 mg. Τρεις μήνες μετά τη διακοπή της κυκλοσπορίνης Α και της μεθυλοπρεδνιζολόνης, η ασθένεια του υποτροπίασε με 6,4% βλαστικά κύτταρα μυελού των οστών όταν είχε ακόμα πλήρη χιμαιρισμό δότη, και προχώρησε γρήγορα με 56,5% βλαστικά κύτταρα μυελού των οστών με κυτταρομετρία ροής 10,6 μήνες μετά την αχλο-ΣΣΣ, και μη ανιχνεύσιμο χιμαιρισμό δότη ταυτόχρονα. Έλαβε χημειοθεραπεία με MOEP (3 ημερήσιες δόσεις μιτοξαντρόνης 10 mg, βινδεσίνη 4 mg, 3 ημερήσιες δόσεις ετοποσίδης 100 mg, και 5 ημερήσιες δόσεις δεξαμεθαζόνης 15 mg) και είχε σοβαρή κατάθλιψη του μυελού των οστών και καμία ανταπόκριση με 65,4% βλαστικά κύτταρα μυελού των οστών 1 μήνα μετά τον πρώτο κύκλο MOEP. Στη συνέχεια, έλαβε θεραπεία με το πρωτόκολλο αχλο-ΚΑΡ-Τ 19 κυττάρων. Έλαβε χημειοθεραπεία με μεθυλοπρεδνιζολόνη και βινδεσίνη συν υδροξυουρία και θεραπεία λεμφοεξουδετέρωσης με δαουνρουμπικίνη και κυκλοφωσφαμίδη, και τα βλαστικά κύτταρα μυελού των οστών του μειώθηκαν σε 12,7% πριν από την αχλο-ΚΑΡ-Τ 19 κυττάρων. Τα αχλο-ΚΑΡ-Τ 19 κύτταρα σε δόση 4,91 × 106/kg (2,89 × 107 Τ κύτταρα/kg, 17% αποτελεσματικότητα μεταφύτευσης) χορηγήθηκαν και προκάλεσαν MRD-CR (MRD-CR) και πλήρη χιμαιρισμό δότη εντός 2 εβδομάδων μετά τη μεταφύτευση. Τα αχλο-ΚΑΡ-Τ 19 κύτταρα που χορηγήθηκαν εμφάνισαν ταχεία επέκταση και κορυφώθηκαν με 15.281 αντίγραφα ανά μικρογραμμάριο DNA εντός των πρώτων 2 ημερών μετά τη μεταφύτευση, αλλά μειώθηκαν από 3374 αντίγραφα ανά μικρογραμμάριο DNA την ημέρα 7 σε 468 αντίγραφα ανά μικρογραμμάριο DNA την ημέρα 12. Χρησιμοποιήθηκαν 160 mg μεθυλοπρεδνιζολόνη και 5 mg δεξαμεθαζόνη την ημέρα 11 για τη θεραπεία του βαθμού 3 συνδρόμου απελευθέρωσης κυτοκίνης (CRS). Βίωσε οξεία ΓΧΓΜ 3ου σταδίου εντός 1 μηνός μετά την αχλο-ΚΑΡ-Τ 19 κυττάρων, η οποία ήταν υπό έλεγχο με 5 ημερήσιες δόσεις μεθυλοπρεδνιζολόνης 40 mg συν κυκλοφωσφαμίδη 80 mg που χορηγήθηκαν από την ημέρα 31 μετά την αχλο-ΚΑΡ-Τ 19 κυττάρων. Ωστόσο, 1 μήνα μετά την απόκτηση MRD-CR, η ασθένεια του εμφάνισε έντονη εξέλιξη με αύξηση του αριθμού των λευκοκυττάρων από 1,59 × 109 σε 12,52 × 109/L και αντίστοιχο ποσοστό κυκλοφορούντων βλαστών από 1,39 έως 67,37% εντός 2 εβδομάτων. Τα αχλο-ΚΑΡ-Τ 19 κύτταρα εμφάνισαν υψηλή κυτταρική δραστηριότητα και κορυφώθηκαν με 59,67% βλαστών που είχαν το πρότυπο έκφρασης CD19+ CD34+ CD10+ CD22+ CD38+ CD58+ CD33- CD20- CD13- CD15-. Ταυτόχρονα, τα αχλο-ΚΑΡ-Τ 19 κύτταρα ήταν μη ανιχνεύσιμα και δεν υπήρχε χιμαιρισμός δότη. Σε αυτή την περίπτωση, άλλες θεραπείες συμπεριλαμβανομένων των ΤανΚΑΡ-Τ 19/22 κυττάρων αντί της διάσωσης χημειοθεραπείας ή της επαναχορήγησης των ΤΚ 19 κυττάρων θα μπορούσαν να αποτελέσουν μια πιθανή θεραπευτική επιλογή για αυτόν τον ασθενή λόγω της κακής ανταπόκρισης στη διάσωση χημειοθεραπείας και της κακής εμμονής των ΤΚ 19 κυττάρων που χορηγήθηκαν. Ωστόσο, το υψηλότερο φορτίο όγκου και το βραχυπρόθεσμο διάστημα μετά τη διακοπή των στεροειδών αύξησε σημαντικά τον κίνδυνο αποτυχίας της παραγωγής των αυτόλογων ΤΚ 19 κυττάρων. Ωστόσο, η δωρεά από τον δότη ΤανΚΑΡ-Τ 19/22 κυτταρική θεραπεία ήταν μια βέλτιστη προσέγγιση για να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα, αλλά όπως είναι γνωστό, οι θεραπείες με μονοκλωνικά ΤΚ κύτταρα δεν θα έπρεπε να υποστηρίζονται συστηματικά σε περίπτωση προηγούμενης ΓΧΘ που απαιτούσε στεροειδή κυρίως λόγω της αυξημένης ανησυχίας για τον υψηλό κίνδυνο επανενεργοποίησης της ΓΧΘ. Μετά από προσεκτική εξέταση των κλινικών οφελών και των κινδύνων της δεύτερης χορήγησης μονοκλωνικών ΤΚ κυττάρων, ο ασθενής εντάχθηκε στο συμπόνιατικό μας κλινικό πρωτόκολλο χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά ΤΚ 19/22 κύτταρα. Ο πατέρας του υποβλήθηκε σε aferesis και τα μονοκλωνικά κύτταρα του περιφερικού αίματος (ΜΟΚ) χρησιμοποιήθηκαν για την προετοιμασία των ΤΚ 19/22 κυττάρων. Ο ασθενής έλαβε κυτταρομειωτική χημειοθεραπεία με βινδεσίνη 4 mg και πέντε ημερήσιες δόσεις μεθυλπρεδνιζολόνης 80 mg και τρεις ημερήσιες δόσεις υδροξυουρίας 3 g ακολουθούμενες από χημειοθεραπεία με λεμφοδελέπηση με idarubicin σε συνολική δόση 30 mg και κυκλοφωσφαμίδη σε συνολική δόση 3 g. Η προγραμματισμένη αναρρόφηση του μυελού των οστών μετά την προαναφερθείσα χημειοθεραπεία και πριν από τη χορήγηση των μονοκλωνικών ΤΚ 19/22 κυττάρων δεν πραγματοποιήθηκε λόγω κακής συμμόρφωσης του ασθενή. Δύο ημέρες αργότερα, ο ασθενής έλαβε θεραπεία με μονοκλωνικά ΤΚ 19/22 κύτταρα σε συνολική δόση 4,72 × 106 ΤΚ 19/22 κυττάρων ανά χιλιόγραμμο (3,05 × 107 Τ κύτταρα ανά χιλιόγραμμο, 15% αποτελεσματικότητα μεταμόσχευσης) χορηγούμενα μέσω κλασματικής χορήγησης (D0, 30%· D1, 70%) για λόγους ασφαλείας (Εικ. και). Τα υλικά και οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν στην παραγωγή του TanCAR-T 19/22 έχουν περιγραφεί προηγουμένως [–], με την εξαίρεση του μορίου του CAR και της πηγής των PBMCs που χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή των κυττάρων του TanCAR-T 19/22. Το TanCAR-19/22 ήταν ένα μοριακό τάνδομ CAR, που αποτελούνταν από ένα αντι-CD22 scFv που προερχόταν από το ποντικό m971 mAb [] και ένα αντι-CD19 scFv που προερχόταν από το ποντικό FMC63 mAb [], που ενώθηκαν σε τάνδομ, την ανθρώπινη άρθρωση CD8α και την περιοχή της μεμβράνης, και τις ανθρώπινες περιοχές σηματοδότησης CD137 και CD3ζ. Ένα σχηματικό του TanCAR-19/22 παρουσιάζεται στο σχήμα α. Τα PBMCs που χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή των κυττάρων του TanCAR-T 19/22 συλλέχθηκαν με λευκαφαίρεση αντί για φρέσκο περιφερικό αίμα (PB). Η κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της αποτελεσματικότητας της μεταφύτευσης TanCAR-19/22 και την ποσοτικοποίηση των απλο-TanCAR-T 19/22 κυττάρων σε κλινικά δείγματα χρησιμοποιώντας ένα ειδικό για το τμήμα της βιοτίνης-SP-AffiniPure αντι-μυϊκής IgG, F (ab') 2 αντισώματος κατσίκας (Jackson ImmunoResearch, ΗΠΑ) και αντισώματος PE στρεπταβιτίνης (BD Biosciences, ΗΠΑ). Τα απλο-TanCAR-T 19/22 κύτταρα σε κλινικά δείγματα μετρήθηκαν επίσης με qPCR όπως περιγράφεται []. Η έκταση του μοσχεύματος του δότη σε κλινικά δείγματα αξιολογήθηκε με τη χρήση σύντομης ενίσχυσης επαναληπτικού τάνδου και πολυπλεξίας PCR με φθορισμό σε συνδυασμό με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση όπως περιγράφεται []. Τα επίπεδα του ορού της ιντερλευκίνης (IL)-2, IL-6, IL-8, και IL-10 και του παράγοντα νέκρωσης όγκων-α αναλύθηκαν κατά παρτίδες όπως περιγράφεται []. Η λίστα των κυττάρων πριν από το πρωτόκολλο των κυττάρων haplo-TanCAR-T 19/22 έδειξε ότι επικρατούσαν τα βλαστικά κύτταρα με απουσία των φυσιολογικών προδρόμων του μυελού. Η κυτταρομετρία ροής του μυελού την 14η ημέρα μετά την έγχυση των κυττάρων haplo-TanCAR-T 19/22 έδειξε ότι υπήρχαν 0,73% υπολειμματικά βλαστικά κύτταρα του μυελού. Τα υπολειμματικά λευχαιμικά βλαστικά κύτταρα εμφάνισαν το πρότυπο έκφρασης CD34+ CD10+ CD22+ CD38+ CD33+ CD19− CD20−, το οποίο δεν ανιχνεύθηκε με κυτταρομετρία ροής την 28η ημέρα χωρίς περαιτέρω θεραπεία (α). Δεδομένης της ελλιπούς ανάκαμψης των αιμοπεταλίων και του απόλυτου αριθμού ουδετερόφιλων την 28η ημέρα, η ασθενής πέτυχε MRD-CRi την 28η ημέρα μετά την έγχυση. Δεν υπήρχε ένδειξη βλαστικών κυττάρων στο μυελό με κυτταρομετρία ροής ή με σειρά χρονικών σημείων για 14 μήνες (β και πρόσθετο αρχείο: Σχήμα S1). Ο μυελός είχε ανακατασκευή της φυσιολογικής αιμοποίησης την 56η ημέρα με εξαίρεση τον αριθμό αιμοπεταλίων που δεν είχε ανακτηθεί σε επίπεδο 36 × 109/L κατά την ημερομηνία της παρούσας έκθεσης. Ο πλήρης χιμαιρισμός του δότη καθιερώθηκε την 14η ημέρα μετά την έγχυση και παρέμεινε σταθερός από τότε. Μετά την έγχυση, τα κύτταρα haplo-TanCAR-T 19/22 αυξήθηκαν και κορυφώθηκαν σε επίπεδο 30,7% των κυκλοφορούντων Τ κυττάρων την ημέρα 12, ακολουθούμενη από μια φάση συρρίκνωσης με χαμηλό επίπεδο 0,45% των κυκλοφορούντων Τ κυττάρων την ημέρα 28. Αυτό συνέπεσε με την εξάλειψη των κυκλοφορούντων Β κυττάρων που ήταν σχεδόν μη ανιχνεύσιμα την ημέρα 28 με κυτταρομετρία ροής. Τα κύτταρα haplo-TanCAR-T 19/22 ήταν ακόμα μετρήσιμα με χαμηλό επίπεδο 2,29% των κυκλοφορούντων Τ κυττάρων και τα κυκλοφορούντα Β κύτταρα δεν είχαν ακόμα ανακάμψει την στιγμή της παρούσας έκθεσης (Εικ. γ και Πρόσθετο αρχείο: Σχήμα S2). Τα κύτταρα haplo-TanCAR-T 19/22 ήταν επίσης παρόντα με κυτταρομετρία ροής σε όλα τα σημεία χρόνου αξιολόγησης της ανταπόκρισης σε BM που ελήφθη κατά την αξιολόγηση της ανταπόκρισης, και η χρόνια απλασία Β κυττάρων τεκμηριώθηκε (Εικ. δ και Πρόσθετο αρχείο: Σχήμα S2). Παρατηρήθηκε συνολική συμφωνία μεταξύ της επέκτασης και της εμμονής των κυττάρων haplo-TanCAR-T 19/22 σε PB που μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής και qPCR. Κατά την στιγμή της παρούσας έκθεσης, το DNA TanCAR-19/22 παρέμεινε ανιχνεύσιμο με 1134 και 396 αντίγραφα ανά μικρογραμμάριο DNA σε PB και BM, αντίστοιχα (Εικ. ε). Μετά την έγχυση των κυττάρων haplo-TanCAR-T 19/22, ο ασθενής εμφάνισε CRS βαθμού 3 σύμφωνα με την κλίμακα βαθμολόγησης του UPenn [, ]. Πυρετός έως 38,8 °C εμφανίστηκε εντός 24 ωρών μετά την έγχυση των κυττάρων haplo-TanCAR-T 19/22, διήρκεσε 11 ημέρες και έγινε αφυπνεία την 12η ημέρα μετά από θεραπεία με χαμηλότερη δόση tocilizumab 160 mg (1,6 mg/kg) και etanercept 50 mg την 8η ημέρα (Εικ. α). Πολλαπλά επίπεδα κυτοκίνης στο ορό είχαν αυξηθεί σημαντικά 7 ημέρες μετά από έγχυση και σχεδόν επανήλθαν στις τιμές αναφοράς την 41η ημέρα (Εικ. β, γ), όπου τα επίπεδα της ιντερλευκίνης (IL)-6 κορυφώθηκαν στις 3377 pg/mL (88 φορές πάνω από την αρχική τιμή) την 11η ημέρα. Η ασπαρτική αμινοτρανσφεράση και η λακτατική αφυδρογονάση αυξήθηκαν σημαντικά 8 έως 10 ημέρες μετά από έγχυση, κορυφώθηκαν στις 1529.1 U/L (38 φορές πάνω από την ανώτερη φυσιολογική τιμή) και 2027.8 U/L (13 φορές πάνω από την αρχική τιμή) την 12η ημέρα, και επανήλθαν στις τιμές αναφοράς την 21η ημέρα με την καλύτερη υποστηρικτική φροντίδα (Εικ. δ, ε). Ο ασθενής εμφάνισε επίσης διαταραχή της πήξης με παρατεταμένο χρόνο ενεργοποιημένης μερικής θρομβοπλαστίνης, αυξημένα D-dimer και μειωμένες συγκεντρώσεις ινωδολυτικών παραγόντων, καθώς και διαρροή τριχοειδών με υποαλβουμιναιμία βαθμού 2 παρά την εντατική υποστήριξη με πρωτεΐνες κατά τη διάρκεια της CRS, η οποία υποχώρησε την 23η ημέρα (Εικ. στ-ζ). Η προηγούμενη οξεία GVHD του δέρματος σταδίου 3 που ήταν υπό έλεγχο επανενεργοποιήθηκε και εξελίχθηκε γρήγορα σε οξεία GVHD του δέρματος σταδίου 4 με νέα εμφάνιση τοπικών ελκών του δέρματος και του βλεννογόνου του στόματος 11 ημέρες μετά την έγχυση των κυττάρων haplo-TanCAR-T 19/22 (α). Η συγκέντρωση ολικής χολερυθρίνης στο πλάσμα αυξήθηκε συνεχώς από την 12η ημέρα και αυξήθηκε σε 134 μmol/L την 21η ημέρα (β). Δεδομένης της ταχέως εξελισσόμενης οξείας GVHD του δέρματος και της εμπλοκής του ήπατος, χορηγήθηκε χαμηλότερη δόση μεθυλπρεδνιζολόνης 20 mg ημερησίως ως αρχική δόση με επακόλουθη μείωση σε προσπάθεια εξισορρόπησης των οφελών και των κινδύνων της συστηματικής ανοσοκαταστολής από την 21η ημέρα και διακόπηκε την 39η ημέρα. Το εξάνθημα του δέρματος και η ολική χολερυθρίνη του ορού βελτιώθηκαν σημαντικά μετά από αυτές τις θεραπείες. Ωστόσο, οι εκδηλώσεις οξείας GVHD του εντέρου κυρίως συμπεριλαμβανομένης της διάρροιας συνέβησαν από την 50η ημέρα, και η ολική χολερυθρίνη του ορού αυξήθηκε ξανά, υποδεικνύοντας οξεία GVHD βαθμού 3. Δόθηκαν 16 δόσεις μεθυλπρεδνιζολόνης 20 mg ημερησίως από την 78η ημέρα, ελέγχοντας σημαντικά τη διάρροια και την ολική χολερυθρίνη του ορού. Αυτός ο ασθενής εμφάνισε στη συνέχεια μέτρια χρόνια GVHD που εκδηλώθηκε κυρίως ως σκληροδερμία, διάρροια και απώλεια βάρους. Η επίμονη θρομβοπενία με αριθμό αιμοπεταλίων που κυμαινόταν από 15 × 109 έως 43 × 109/L χωρίς μετάγγιση αιμοπεταλίων θα μπορούσε να αναγνωριστεί ως εκδήλωση χρόνιας GVHD στο πλαίσιο της ανασύστασης της φυσιολογικής αιμοποίησης. Η συστηματική ανοσοκατασταλτική θεραπεία μειώθηκε σταδιακά εντός 2 μηνών με μεθυλπρεδνιζολόνη 4 mg κάθε δεύτερη ημέρα και μεθοτρεξάτη 5 mg μία φορά την εβδομάδα και σιρόλιμους 1 mg ημερησίως ως ελάχιστη δόση συντήρησης από την 154η ημέρα έως την ημερομηνία της παρούσας έκθεσης (β), διατηρώντας την χρόνια GVHD υπό καλό έλεγχο.