Μια 47χρονη γυναίκα (βάρος: 62 kg) διαγνώστηκε με χρόνια ενεργή HBeAg-θετική ηπατίτιδα Β το 1996. Οι ιογενείς παράμετροι όπως το HBeAg, το αντι-HBe IgG και το ιικό φορτίο του HBV από κατεψυγμένα δείγματα μετρήθηκαν ταυτόχρονα από έναν μοναδικό χειριστή για να μειωθούν οι ενδο- και ενδο-δοκιμαστικές διακυμάνσεις. Το HBeAg και το αντι-HBe προσδιορίστηκαν με ηλεκτροχημειοφωταύγεια (ELECSYS 2010, Roche Diagnostic). Τα επίπεδα ιικού φορτίου του HBV προσδιορίστηκαν με PCR πραγματικού χρόνου (COBAS TaqMan Roche Molecular Systems, δυναμικό εύρος 30 IU/ml έως 110.000.000 IU/ml) []. Η φλεγμονή του ήπατος μετρήθηκε με τα επίπεδα της αλανίνης αμινοτρανσφεράσης του ορού (ALT). Για την ανάλυση αλληλουχίας, τα γονίδια HBV pol και preC-core αλληλουχίστηκαν με εκκινητές όπως περιγράφεται προηγουμένως []. Η ανάλυση έγινε με τη χρήση ενός οργάνου ABI3100 (Applied Biosystems) και οι αλληλουχίες που εισήχθησαν σε αυτό το έργο καθώς και αυτές που ελήφθησαν από τη βάση δεδομένων GenBank ευθυγραμμίστηκαν με το ClustalX v1.83 [] και επεξεργάστηκαν με το Bioedit v7.0.9.0 [] Το γονότυπο HBV αξιολογήθηκε με φυλογενετική συμπερασματολογία χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο Neighbor-joining με το μοντέλο μοριακής εξέλιξης Kimura-two-parameter στο λογισμικό MEGA v3.1 [] Συστάδες από τα δύο γονίδια ελήφθησαν σε διαφορετικές χρονικές στιγμές κατά τη διάρκεια της αντι-ιικής θεραπείας (Σχήμα). Μια πιο λεπτομερειακή ανάλυση των κλώνων του γονιδίου του HBV pol έγινε σε επτά επιλεγμένα ιικά απομονωμένα δείγματα από ορούς που συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια των διαδοχικών θεραπειών. Κάθε επιλεγμένο προϊόν PCR του γονιδίου pol κλωνοποιήθηκε σε έναν φορέα pGEM-T Easy σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Promega, Wisconsin, ΗΠΑ) και τουλάχιστον 15 κλώνοι αναλύθηκαν περαιτέρω με αλληλούχιση. Αυτό επέτρεψε την ανάλυση της εξέλιξης των ιικών οιονεί ειδών υπό τις διαδοχικές αντι-ιικές πιέσεις με βάση την ανάλυση του γονιδίου pol. Οι παρεμβάσεις θεραπείας κατά του ιού της ηπατίτιδας Β συνοδευόμενες από την κινητική του ιικού φορτίου του ιού της ηπατίτιδας Β και του επιπέδου ALT απεικονίζονται στο σχήμα. Η θεραπεία ξεκίνησε όταν το ιικό φορτίο του ιού της ηπατίτιδας Β αυξήθηκε σε 6,5 × 106 IU/ml. Το 1998 όταν ο ασθενής έλαβε θεραπεία με IFN-α 5 MU τρεις φορές την εβδομάδα για 30 εβδομάδες, το επίπεδο του DNA του ιού της ηπατίτιδας Β ήταν χαμηλότερο από το όριο ανίχνευσης. Η θεραπεία διακόπηκε και αντικαταστάθηκε το 1999 με λαμιβουδίνη (150 mg μία φορά την ημέρα). Μετά από 2 χρόνια συνεχούς θεραπείας, το DNA του ιού της ηπατίτιδας Β ήταν ανιχνεύσιμο (15,5 × 106 IU/ml). Το HBeAg παρέμεινε αρνητικό με ανιχνεύσιμα αντι-HBe κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου θεραπείας. Το 2001, μετά από 6μηνη διακοπή, το επίπεδο του ιικού φορτίου του ιού της ηπατίτιδας Β κατέδειξε μια μεταθεραπευτική έξαρση (1 × 108 IU/ml). Στο τέλος του 2003 η θεραπεία με λαμιβουδίνη επαναεισήχθη (150 mg μία φορά την ημέρα). Συνοδευόταν από ένα σπάνιο γεγονός επαναφοράς σε προφίλ HBeAg θετικό/αντι-HBe αρνητικό, το οποίο παρέμεινε ανιχνεύσιμο για δύο χρόνια. Το ιικό φορτίο έφθασε τα 3,1 × 106 IU/ml σε αυτό το σημείο. Δέκα μήνες αργότερα, το 2006, το σχήμα λαμιβουδίνης αντικαταστάθηκε με μονοθεραπεία με adefovir (10 mg/ημέρα). Αρχικά, τα επίπεδα ιικού φορτίου ήταν χαμηλά (8,5 × 104 IU/ml) αλλά μετά από 48 εβδομάδες θεραπείας τα επίπεδα αυτά έφτασαν τα 7,15 × 106 IU/ml. Τα επίπεδα ALT ήταν φυσιολογικά κατά τη διάρκεια αυτού του διαστήματος. Η επανενεργοποίηση της αντιγραφής του HBV θεωρήθηκε δεδομένη λαμβάνοντας υπόψη την ταυτόχρονη ανίχνευση των HBeAg/αντι-HBe [] και την υψηλή αντιγραφή που ανιχνεύθηκε. Η συσχέτιση του HBeAg και του αντι-HBe δεν φαίνεται να είναι ασυνήθιστη μεταξύ των ασθενών που δεν είχαν λάβει προηγουμένως αντιιική θεραπεία, αλλά η επικράτησή της σε ασθενείς που είχαν λάβει θεραπεία είναι άγνωστη. Αυτό το ορολογικό πρότυπο έχει συσχετιστεί με εκτεταμένη βλάβη των ηπατοκυττάρων και σοβαρή ανοσο-μεσολαβούμενη ηπατική βλάβη και συνακόλουθη δυσλειτουργία []. Έξι μήνες αργότερα, το επίπεδο ALT αυξήθηκε ελαφρά (1,5 × ανώτερο φυσιολογικό όριο - UNL -) και ξεκίνησε μονοθεραπεία με entecavir (1 mg ημερησίως). Μετά από 5 μήνες μονοθεραπείας με εντεκαβίρη, προστέθηκε στο θεραπευτικό σχήμα η τενοφοβίρη (300 mg μία φορά ημερησίως) για διπλή θεραπεία. Το HBV DNA μειώθηκε σε 1 × 105 IU/ml για τέσσερις μήνες, αλλά τρεις μήνες αργότερα το ιικό φορτίο έφθασε > 1.1 × 108 IU/ml. Επιπλέον, η αύξηση του επιπέδου της ALT (20× UNL) υποδήλωνε φλεγμονή του ήπατος. Κατά τις επόμενες 48 εβδομάδες, η ιική αντιγραφή μειώθηκε ελαφρώς σε 6.1 × 106 IU/ml αλλά επανήλθε πρώτα σε 3.6 × 107 IU/ml και αργότερα σε > 1.1 × 108 IU/ml. Πιο πρόσφατα (δεύτερο εξάμηνο του 2010), τα επίπεδα του HBV DNA κυμαίνονταν μεταξύ 4.3 × 104 IU/ml και 4.9 × 107 IU/ml. Μέχρι το τέλος της παρακολούθησης της μελέτης, μπορέσαμε να μετρήσουμε τη συγκέντρωση της τενοφοβίρης στο πλάσμα με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης σε τρεις συνεχόμενες δειγματοληψίες 20 ωρών μετά τη χορήγηση που έφτασαν τα 71.6 ng/ml ± 47.6 (μέση τιμή ± SD). Τα επίπεδα ALT-AST παρέμειναν ελαφρώς αυξημένα (2× UNL) κατά τη διάρκεια των τελευταίων δύο ετών παρακολούθησης. Τα απομονωμένα στελέχη του HBV από τον ασθενή αποδόθηκαν στον γονότυπο Α2 με βάση τη φυλογενετική συγγένεια μεταξύ των μερικών γονιδιακών ακολουθιών του HBV από τα γονίδια pol και preC-C. Μια περαιτέρω διαχρονική γονοτυπική ανάλυση, συμπεριλαμβανομένης της σύνθεσης των οιονεί ειδών των στελεχών του HBV που απομονώθηκαν από τον ασθενή, αποκάλυψε την παρουσία μεταλλάξεων αντίστασης με βάση τις ακολουθίες του γονιδίου pol (Πίνακας). Στην αρχή της θεραπείας με λαμιβουδίνη, το HBV ήταν άγριου τύπου σε όλα τα απομονωμένα στελέχη. Μετά από 2 χρόνια υπό τέτοια θεραπεία, αυτός ο ιικός πληθυσμός αντικαταστάθηκε εντελώς από τη μετάλλαξη rtM204I - που εμφάνιζε ομοιογενώς αντίσταση στη λαμιβουδίνη. Όταν η θεραπεία διακόπηκε για 6 μήνες, η σύνθεση των οιονεί ειδών αποτελούνταν σχεδόν αποκλειστικά από τις ακολουθίες νουκλεοτιδίων του άγριου τύπου pol, με εξαίρεση μια μικρή συμβολή (< 10%) που εμφάνιζε τη μετάλλαξη I233V που σχετίζεται με την αντίσταση στο adefovir. Όταν η θεραπεία με λαμιβουδίνη επαναεισήχθη, και μέχρι να χορηγηθεί το entecavir συν tenofovir, οι διπλές μεταλλάξεις rtL180M και rtM204I που σχετίζονται με την αντίσταση στη λαμιβουδίνη ανιχνεύθηκαν σταθερά. Στο πλαίσιο του τελευταίου θεραπευτικού σχήματος, μόνο εφήμερα και με μικρή συμβολή (~5%), ανιχνεύθηκαν οι μεταλλάξεις A181T και T184L που σχετίζονται με την αντίσταση στη λαμιβουδίνη και την adefovir, αντίστοιχα. Επιπλέον, άλλες δύο παραλλαγές ανιχνεύτηκαν στον καταλυτικό τομέα της αντίστροφης μεταγραφάσης κατά τη στιγμή της αντοχής στη λαμιβουδίνη. Αυτές οι παραλλαγές rtA200V και rtI253V παρέμειναν παρούσες κατά τη διάρκεια της θεραπείας με εντεκαβίρη και ανιχνεύτηκαν επίσης σε δείγματα που αναλύθηκαν μετά από την εμφάνιση της αντοχής κατά τη διάρκεια της θεραπείας με εντεκαβίρη. Ο χαρακτηρισμός του γονιδιώματος του HBV σε επίπεδο preC-C έδειξε την παρουσία της διπλής μετάλλαξης Α1762Τ και G1764Α που ανιχνεύθηκε νωρίς όταν ο ασθενής δεν είχε λάβει θεραπεία, παραμένοντας σε αυτή την κατάσταση καθ' όλη τη διάρκεια της παρακολούθησης. Η μετάλλαξη Τ1753C ανιχνεύθηκε επίσης με συνέπεια. Η παρουσία αυτών των μεταλλάξεων του πυρήνα του προδρόμου είναι επίσης συνδεδεμένη με το προαναφερθέν προφίλ HBeAg-antiHBe που βρέθηκε σε αυτόν τον ασθενή, όπως αναφέρθηκε πρόσφατα [].