Ένα θηλυκό, στειρωμένο, 10 ετών σκυλί ράτσας Γιορκσάιρ, βάρους 2,1 κιλών, παρουσιάστηκε σε τοπικό νοσοκομείο με δύσπνοια. Η παρουσία του περικαρδιακού υγρού επιβεβαιώθηκε με υπερηχογράφημα, το οποίο στη συνέχεια συλλέχθηκε υπό καθοδήγηση υπερήχων, και εξετάστηκαν οι φυσικές και χημικές ιδιότητες του περικαρδιακού υγρού για να καθοριστούν τα χαρακτηριστικά του. Οι δοκιμές βακτηριακής και μυκητιακής καλλιέργειας έδωσαν αρνητικά αποτελέσματα, υποδεικνύοντας ότι δεν υπήρχε ανάπτυξη. Δεν υπήρχαν ανωμαλίες στο πλήρες αιματολογικό και χημικό προφίλ ορού. Ο ασθενής παραπέμφθηκε στο Πανεπιστημιακό Κτηνιατρικό Νοσοκομείο του Κανγκγουόν. Συνολικά 30 ml περικαρδιακού υγρού συλλέχθηκαν από την περιοχή όπου παρατηρήθηκε υπό καθοδήγηση υπερήχων με τοπική αναισθησία. Χορηγήθηκε ενδοφλεβίως 1 mg/kg (0,2 ml) αλφαξαλόνης, ακολουθούμενη από επιπλέον 0,1 ml. Μετά από 10-15 λεπτά, χορηγήθηκαν 4 ml 2% λιδοκαΐνης αραιωμένης σε φυσιολογικό ορό (1:1). Το αιματηρό περικαρδιακό υγρό αλείφθηκε και έγινε κυτταρολογική εξέταση. Στην κυτταρολογική εξέταση, παρατηρήθηκε διπλοπυρήνωση, ανισοκυττάρωση, ανισοκαρυωσία, ανώμαλα πυρηνίδια (μεγάλα, γωνιώδη και πολλαπλά), άφθονο βασεόφιλο κυτταρόπλασμα, υψηλή πυρηνικοκυτταρική αναλογία (Ν:Κ) και χονδροειδές χρωματοειδές, καθώς και μεγάλα άτυπα πολυπυρηνικά κύτταρα, που υποδεικνύουν κακοήθεια υψηλού βαθμού. Τα κύτταρα αυτά μπορούν να βρεθούν είτε ως μεμονωμένα είτε ως συσσωματώματα με έναν αριθμό ερυθροκυττάρων. Παρατηρήθηκαν πολυάριθμα μη εκφυλιστικά ουδετερόφιλα και μακροφάγα μαζί με αυτά τα κύτταρα. Παρατηρήθηκε ερυθροφαγία, που υποδεικνύει χρόνια αιμορραγία (Εικ. Α-Γ). Η διάκριση μεταξύ των αντιδραστικών μεσοθηλιακών κυττάρων και του μεσοθηλιώματος στο περικαρδιακό υγρό είναι δύσκολη, ειδικά στην παρουσία φλεγμονής πλούσιας σε ουδετερόφιλα. Ως εκ τούτου, ο συγγραφέας είχε ως στόχο να ανακαλύψει αν τα παρατηρούμενα κύτταρα ήταν αντιδραστικά μεσοθηλιακά, μεσοθηλιώματα ή κύτταρα αδενοκαρκινώματος μέσω ανοσοκυτταροχημείας χρησιμοποιώντας πέντε δείκτες (κυτοκερατίνη, βμιτίνη, δεσμίνη, Ε-καδρετίνη και καλρετίνη) [, –]. Η ανοσοκυτταροχημεία εκτελέστηκε τροποποιώντας τη μέθοδο που συνιστούσαν οι κατασκευαστές αντισωμάτων. Τα κύτταρα μεσοθηλιώματος ως θετικός έλεγχος για κάθε ένα από τα πρωτογενή αντισώματα παρασκευάστηκαν από αποθηκευμένα κύτταρα επιχρίσματος, τα οποία συλλέχθηκαν από έναν σκύλο ασθενή που διαγνώστηκε με μεσοθηλίωμα μετά θάνατον. Εκείνη την εποχή, τα κύτταρα μεσοθηλιώματος επιχρίστηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε μεθανόλη για 10 λεπτά και αποθηκεύτηκαν σε γυάλινο βάζο που περιείχε 1x ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών αλάτων (PBS) στους 4 ℃ για αρκετούς μήνες. Για τη χρώση της καλρετινίνης και της Ε-καδρετίνης, τα επιχρίσματα κυττάρων από περικαρδιακές εκχύσεις στερεώθηκαν σε μεθανόλη στους -20 °C για 10 λεπτά και πλύθηκαν τρεις φορές με PBS (Sigma-Aldrich, Burlington, MA, ΗΠΑ) για 2 λεπτά. Τα πρωτογενή αντισώματα κατά της καλρετινίνης (1:1000, Sigma C7479; ξενιστής: κουνέλι; δραστικότητα: ανθρώπινα, ποντίκια, σκύλος) και αντι-Ε-καδρετίνης, Alexa Fluor 594 (10 μg/ml, Biolegend 147,306; ξενιστής: αρουραίος; επαληθευμένη δραστικότητα: cynomolgus, σκύλος, χοίρος), αραιώθηκαν με 1% βοείου ορού αλβουμίνη (BSA)/PBS (Komabiotech, Σεούλ, Νότια Κορέα). Μετά από ολονύκτια επώαση με τα πρωτογενή αντισώματα στους 4 °C, τα επιχρίσματα πλύθηκαν τρεις φορές σε PBS για 2 λεπτά. Το δευτερεύον αντισώμα Alexa Fluor 488 (10 μg/ml, Invitrogen, A11034) αντι-κουνελιού ανοσοσφαιρίνη G (IgG; βαριά + ελαφριά αλυσίδα [H + L]) αραιώθηκε με 1% BSA/PBS. Μετά από ολονύκτια επώαση με τα δευτερεύοντα αντισώματα στους 4 °C, τα επιχρίσματα πλύθηκαν τρεις φορές σε PBS για 2 λεπτά. Τα επιχρίσματα χρωματίστηκαν με μέσο μοντάζ που περιείχε DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, ΗΠΑ) και εξετάστηκαν με χρήση ενός λέιζερ-σαρωτή LSM 780 (Carl Zeiss, Jena, Γερμανία). Για τη χρώση της κυτοκερατίνης και της βιμεντίνης, χρησιμοποιήθηκαν μονοκλωνικά αντισώματα της πανκυτοκερατίνης (AE1/AE3), το eFluor™ 570 (1 µg/ml, Invitrogen 41-9003-82, Carlsbad, CA, ΗΠΑ), το μονοκλωνικό αντίσωμα της βιμεντίνης (V9) και η φλουορεσκεΐνη (1 µg/ml, Invitrogen 11-9897-82). Το ίδιο πρωτόκολλο (μέθοδος χρώσης ή απαιτούμενος χρόνος) που περιγράφεται παραπάνω, εφαρμόστηκε με τη χρήση διαφορετικού δευτερεύοντος αντισώματος. Για τη χρώση της δεσμίνης, χρησιμοποιήθηκε ως πρωτογενές αντίσωμα το μονοκλωνικό αντίσωμα της δεσμίνης (D33) (1:100, Invitrogen MA5-13259) και ως δευτερογενές αντίσωμα η αντιμυϊκή ανοσοσφαιρίνη κατσίκας (H+L) Alexa Fluor 488 (1:500, Invitrogen A28175). Ακολουθήθηκαν οι ίδιες διαδικασίες με αυτές που περιγράφηκαν παραπάνω. Η ανοσοϊστοχημεία του περικαρδιακού υγρού ήταν θετική για τη βινιτένη (Εικ. Α) και τη κυτοκερατίνη (Εικ. Β). Το DAPI (Εικ. Γ) και η συγχωνευμένη εικόνα των Εικ. Α-Γ παρουσιάζονται στην Εικ. Δ. Ήταν επίσης θετική για τη δεσμίνη (Εικ. Ε). Το DAPI (Εικ. ΣΤ) και η συγχωνευμένη εικόνα των Εικ. Ε, ΣΤ παρουσιάζονται στην Εικ. Ζ, Η. Τέλος, ήταν θετική για την καλρετινίνη (Εικ. Α) και την Ε-καδρετίνη (Εικ. Β). Το DAPI (Εικ. Γ) και η συγχωνευμένη εικόνα των Εικ. Α-Γ παρουσιάζονται στην Εικ. Δ. Ως εκ τούτου, διαγνώστηκε κακοήθες μεσοθηλίωμα [,, –].