Die Patientin ist ein Mädchen, jetzt 11 Jahre alt, geboren drei Wochen vor dem errechneten Termin, Geburtsgewicht 2720 g. Es gab keine Fütterungsprobleme in der Kindheit oder später. Die motorische und sprachliche Entwicklung war verzögert: Sie ging ohne Unterstützung mit 2½ Jahren und sagte mit 3 Jahren ihre ersten Wörter. Mit 10 Jahren kannte sie das Alphabet und versuchte, Buchstaben zusammenzusetzen. Sie benutzte Windeln bis zum Alter von 8-9 Jahren. Ihr Schlafmuster ist leicht unregelmäßig mit häufigem Aufwachen. Angeborene Fehlbildungen oder Epilepsie wurden nie festgestellt. Sie hat eine normale Statur mit einer Länge entlang des 25. bis 50. Perzentils und einem Gewicht entlang des 25. Perzentils, aber ihr Kopfumfang lag im unteren Normbereich (2.5. bis 5. Perzentil). Ihre Gesichtszüge sind auch normal - sie ist nicht eindeutig dysmorph. Das Verhalten ist normal ohne autistische Merkmale, aber Bruxismus ist ein Problem. Sie bevorzugt die Gesellschaft jüngerer Kinder. Ihr intellektuelles Niveau wird als vergleichbar mit einer leichten bis mittleren ID bewertet, eine formelle IQ-Prüfung wurde noch nicht durchgeführt. Im Alter von 9 Jahren ergab eine Trio-Whole-Exome-Sequenzierung (WES), bei der die DNA-Sequenzen des Kindes mit der DNA der Eltern verglichen wurden, eine de novo NAA10 (NM_003491.3) c.332 T > G p.V111G-Variante, die durch Sanger-Sequenzierung weiter bestätigt wurde. Wie bei anderen NAA10-Missense-Varianten wirkt sich die V111G-Substitution auf eine hochkonservierte Aminosäure aus. NAA10 ist ein Protein mit 235 Aminosäuren, das die für NAT-katalytische Untereinheiten charakteristische GNAT-Faltung aufweist. Diese Faltung besteht aus sechs oder sieben β-Strängen und vier α-Helices. β-Stränge 2-5 bilden den Kern des Proteins. Diese vier β-Stränge sowie die α2-Helix und die β6-β7-Schleife, die für die Bindung des Substrats wichtig sind, sind hochkonserviert. V111 befindet sich am Ende des β5-Strangs, und eine Valin in dieser Position ist in NAA10-Homologen sowie in mehreren anderen NAT-katalytischen Untereinheiten, für die Kristallstrukturen gelöst wurden, 4U9W (NAA40), 3FTY (NAA50), 5ICV (NAA60) und 4LX9 (ssNAT)) [–] hochkonserviert. Die Seitenkette von V111 bildet zusammen mit Y145, M147, L119 und L109 eine hydrophobe Tasche. Sie befindet sich auch in unmittelbarer Nähe (3,7 Å) zur Schwefelgruppe von Acetyl-CoA (AcCoA), was auf eine Rolle von V111 bei der Positionierung von AcCoA hindeutet. Eine Glycin in dieser Position verursacht keine sterischen Konflikte, aber der Verlust der bulligeren hydrophoben Seitenkette von Valin kann möglicherweise strukturelle Veränderungen hervorrufen, die die Stabilität des Proteins oder die Bindung von AcCoA beeinflussen. Um die Funktion von NAA10-V111G zu bewerten, exprimierten wir zunächst His/MBP-NAA10-WT und His/MBP-NAA10-V111G in E. coli, reinigten die Enzyme und testeten die NAT-Aktivität in vitro. Im Gegensatz zu His/MBP-NAA10-WT war es schwierig, eine gute Proteinexpression von His/MBP-NAA10-V111G zu erzielen, und ein erheblicher Anteil der gereinigten His/MBP-NAA10-V111G-Moleküle eluierte im Leerraum der Säule der Größenausschluss-Chromatographie. Dies deutet darauf hin, dass Teile des Proteinsaggregats in Einheiten größer als 200 kDa vorliegen, was höchstwahrscheinlich auf eine Veränderung der Proteinstruktur oder eine verringerte Proteinstruktur zurückzuführen ist. Enzyme, die in einem Säulenvolumen eluierten, das dem monomeren His/MBP-NAA10-V111G entspricht, wurden auf ihre katalytische Aktivität getestet und zeigten eine etwa 85%ige Verringerung der katalytischen Aktivität im Vergleich zu His/MBP-NAA10-WT. Aufgrund der geringen Expression und des geringen Proteinausdrucks von NAA10-V111G aus E. coli-Transfektion und Proteinfraktionierung, transfizierten wir HeLa-Zellen mit Plasmiden, die entweder das V5-markierte NAA10-WT oder das V5-markierte NAA10-V111G kodieren, und immunisierten sie mit einem V5-markierten Antikörper. Danach wurde die NAT-Aktivität im Niederschlag gemessen. NAA10 und NAA15 bilden einen hochaffinen Proteinkomplex, und wie erwartet wurde das endogene NAA15 mit beiden über exprimierten NAA10-WT-V5 und NAA10-V111G-V5 koimmunpräzipiert. Die Menge an NAA10 und NAA15 in jeder Probe wurde durch SDS-PAGE und Western-Blotting bestimmt. Die Banden aus dem Western-Blotting wurden quantifiziert, und die gemessene katalytische Aktivität wurde mit der Menge an NAA10-V5 in der Probe (d. h. einer Mischung aus monomerem NAA10 und NAA10 im Komplex mit NAA15 – dem NatA-Komplex) korreliert und separat mit der Menge an NAA15 in der Probe (d. h. der Menge des NatA-Komplexes) korreliert. Die Ergebnisse aus dem IP-Aktivitätsexperiment stimmten gut mit unseren bisherigen Erkenntnissen überein: Die Fähigkeit von NAA10-V111G, die saure N-Terminale EEEI24 zu acetylieren, war stark reduziert. Es zeigte sich jedoch auch ein zweites interessantes Merkmal: Wie aus dem Western-Blotting in Fig. hervorgeht, wurde mehr NAA15 mit NAA10-V111G-V5 im Vergleich zu NAA10-WT-V5 koimmunpräzipiert. Dies spiegelte sich auch in unseren NAT-Aktivitätsmessungen wider, wo die immunpräzipierte NAA10-V111G-V5-Probe eine höhere NatA-Produktbildung (für das NatA-Substratpolypeptid SESS24) aufwies als die immunpräzipierte NAA10-WT-V5-Probe, wenn sie mit der Menge an insgesamt in der Probe vorhandenen NAA10-V5 korreliert wurde. Wenn man jedoch die Menge an NAA15 in jeder Probe korreliert, ist die NatA-Produktbildung pro NAA15-Molekül (und damit NatA-Komplex) etwa gleich. Da monomeres NAA10 eine 1000-fach geringere NAT-Aktivität gegenüber dem NatA-Komplex aufweist, ist der Beitrag von monomeren NAA10 zur Acetylierung von SESS24 minimal. Zusammengenommen deutet dies darauf hin, dass NAA10-V111G eine reduzierte katalytische Aktivität in monomerer Form, aber nicht im Komplex mit NAA15 aufweist. Um den Proteinumsatz von NAA10-WT und NAA10-V111G zu bewerten, exprimierten wir V5-markiertes NAA10-WT und NAA10-V111G in HeLa-Zellen und führten Zycloheximid-Verfolgungs-Experimente durch. Wie aus Fig. ersichtlich ist, hat NAA10-V111G-V5 einen höheren Umsatz als NAA10-WT-V5. 2 h nach Zycloheximid-Behandlung war die durchschnittliche Menge an NAA10-V111G-V5 um etwa 80 % reduziert, während die Menge an NAA10-WT-V5 um 20 % reduziert war, bezogen auf die Menge an NAA10-Molekülen vor Zycloheximid-Behandlung. Obwohl die Menge an NAA10-V111G-V5 nach 2 h drastisch reduziert war, scheint sich der Spiegel an NAA10-V111G-V5 auf etwa 20 % zu stabilisieren. Wahrscheinlich ist das übermäßig exprimierte NAA10-V111G-V5 sowohl in einer instabilen monomeren Form, die schnell abgebaut wird, als auch in einem Komplex mit NAA15 vorhanden, der das Enzym stabilisiert und vor Abbau schützt.