Eine 4-jährige männliche eurasische Otter, die 2015 im „Sendaviva, Natural Park of Navarra“ (42°11′31″N, 1°09′54”O) (Nordostspanien) geboren wurde, wurde 2017 in den Wildtierpark „Terra Natura“ (Südostspanien) gebracht. Der Wildtierpark „Terra Natura“ befindet sich in der Umgebung der Stadt Murcia (38°00′40″N, 1°09′54”O). Die Otteranlage bestand aus einem Bereich mit frei zugänglichen Unterständen und einem Teich mit 4 Tieren dieser Art (2 Männchen und 2 Weibchen). Die Otter wurden nicht mit einem Pour-on-Insektizid gegen Sandmücken behandelt. Im August 2019 zeigte das Tier beidseitige Epistaxis, Anorexie, Apathie und Gewichtsverlust (Abb. ). Das Tier wurde vor der Manipulation mit Medetomidin (0,2 mg/kg/i.m.) und Ketamin (20 mg/kg/i.m.) sediert. Vollblut wurde durch Venipunktur aus der Kopfvene entnommen und in ein 1 ml-Rohr mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und ein 1 ml-Rohr ohne Antikoagulans für eine vollständige Blutkörperchenanalyse (CBC) bzw. biochemische Analysen eingefüllt. Die CBC wurde in einem Blutzellenzähler (ADVIA 120 Hematology System, Siemens, Italien) durchgeführt, und die biochemischen Analysen wurden in einem automatischen biochemischen Analysegerät (Olympus AU600 Automatic Chemistry Analyzer, Olympus Europe GmbH, Hamburg, Deutschland) durchgeführt. Außerdem wurde Urin durch ultraschallgeführte Zystozentese für eine Urinanalyse entnommen. Eine echographische Untersuchung des Herzens und der Bauchorgane einschließlich Nieren, Milz, Leber, Gallenblase, Bauchspeicheldrüse und Verdauungssystem wurde durchgeführt. Da die biochemischen und echographischen Ergebnisse mit der klinischen Leishmaniose vereinbar waren, wurden serologische und molekulare Tests durchgeführt, um das Vorhandensein der Infektion zu bestätigen. Die Anwesenheit von anti-Leishmania IgG2-Antikörpern wurde im Serum der Otter mit Hilfe eines zeitaufgelösten immunofluorometrischen Assays (TR-IFMA) getestet, der nach den Angaben von Cantos-Barreda et al. durchgeführt wurde. [] Um zu testen, ob der TR-IFMA-Assay, der für Hunde-Serum validiert ist, auch auf Otter-Serum angewendet werden kann, wurde ein Western-Blot-Assay durchgeführt. Der Western-Blot wurde in Seren von Otter mit Leishmaniose-kompatiblen Anzeichen und von einem Hund mit Leishmania-positivem Serum (TR-IFMA) durchgeführt. Die Seren (1:2000-Verdünnung) wurden unter reduzierenden Bedingungen auf Mini-Polyacrylamid-Gelen (0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 12 % auflösendes Gel und 4 % Stacker-Gel) separiert. Die gelösten Proteine wurden elektrophoretisch auf eine Nitrocellulose-Folie (Bio-Rad, USA) übertragen und in ein ROTI®Lumin-Substrat (Carl Roth, Deutschland) eingebracht, um es 2 h bei Raumtemperatur zu blockieren. Das polyclonale anti-dog IgG2-Schaf-Antikörper (AHP498; Bio-Rad, USA) wurde mit einer 1:1000-Verdünnung als primäres Antikörper verwendet, während das anti-Schaf-IgG-Rinderperoxidase-konjugierte Kaninchenanti-Schaf-Antikörper (HRP) (SAB3700702; Sigma-Aldrich, USA) mit einer 1:1000-Verdünnung als sekundären Antikörper verwendet wurde, um den gebundenen primären Antikörper zu detektieren. Die Detektion erfolgte mit einem Pierce ECL2-Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, USA) und wurde digitalisiert, indem es in einen Typhoon 9410-Scanner (GE Healthcare, USA) eingefügt wurde. Eine etwa 150 kDa-Band wurde sowohl im Otter- als auch im Hundemuster (siehe Abbildung und zusätzliche Datei) beobachtet. Diese Befunde bestätigten, dass der TR-IFMA-Assay mit Schaf-anti-Hund-IgG2 in der Lage war, das IgG2 des Otters zu detektieren. Der TR-IFMA-Assay bestand aus einer nicht kompetitiven indirekten Methode, die auf biotinyliertem K39-rekombinantem Antigen als Capture-Reagenz und anti-Hund-IgG2-Schaf-Antikörper (Schaf-anti-Hund-IgG2, Bio-Rad, USA) Eu3 +-markiert als Detektor basiert. Der Test umfasste Serum von einem kranken, leishmaniepositiven Hund und Serum von einem gesunden, leishmanienegativen Hund als negative Kontrolle. Die Analyse wurde in einem Multilabel-Zähler (VICTOR2 1420, PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Turku, Finnland) durchgeführt. Die Ergebnisse wurden als Einheiten der Fluorometrie für Leishmania (UFL) ausgedrückt. Der Cut-off wurde auf 22 UFL gesetzt. Außerdem wurde ein Enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) (Leiscan® Leishmania ELISA Test, Esteve Veterinaria, Laboratorios Dr. Esteve SA, Barcelona, Spanien) durchgeführt, der spezifische IgG-Antikörper gegen Leishmania spp. nachweist. Die Seren wurden mit 1:20 verdünnt, und die Ergebnisse wurden als S/P-Verhältnis (S/P = Serum/Positivkontrolle) ausgedrückt, das durch die optische Dichte (OD) des Serums/OD der positiven Kontrolle berechnet wurde. Werte von S/P-Verhältnissen über 1,1 wurden als positiv betrachtet. Die Anwesenheit von DNA von Leishmania spp. im Vollblut und im Knochenmark wurde durch Amplifikation der kinetoplastischen DNA-Sequenz von Leishmania spp. mit einem rtPCR-Primer und einer Sonde, die zuvor beschrieben wurden, bewertet.[] Das Knochenmark wurde durch eine feine Nadel aus der kostochondralen Verbindung entnommen und in ein 1 ml-Rohr mit EDTA-Beschichtung geleitet. Die DNA wurde mit dem High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, Deutschland) nach den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die rtPCR wurde im QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) durchgeführt. Der interne Steuerelement-TaqMan-exogene interne positive Kontrollreagenzien (VIC-Probe) (Exo IPC) (Applied Biosystems, CA, USA) wurde einbezogen. Die rtPCR wurde in einem Endvolumen von 20 μl durchgeführt, darunter 1× iTaq Universal Probes Supermix (Bio-Rad, CA, USA), 900 nM von jedem Primer, 200 nM von TaqMan-Sonde, 1× Exo IPC-Mix, 1× Exo IPC-DNA und 50 ng DNA von jeder Probe. Die Zyklusparameter waren: 50 °C für 30 s, 95 °C für 10 min, 45 Zyklen bei 94 °C für 30 s und 55 °C für 1 min. Jeder Amplifikationslauf enthielt positive und negative Kontrollen, und jede Messung wurde dreifach durchgeführt. Für die Identifizierung der Leishmania-Spezies wurden die PCR-Produkte aus den positiven Proben mit dem High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, Deutschland) gereinigt und zur Sequenzierung an die Sektion Molekulare Biologie der Universität Murcia gesendet. Die erhaltenen Sequenzen wurden mit den im GenBank verfügbaren Sequenzen verglichen. Zusätzlich wurden als negative Kontrolle die gleichen Analysen an einer 3-jährigen weiblichen eurasischen Otter aus dem gleichen Wildpark durchgeführt, die keine klinischen Anzeichen aufwies, die mit Leishmaniose vereinbar waren. Alle Ergebnisse werden in der Tabelle angezeigt. Das Auftreten von Leishmaniose wurde bestätigt, und es wurde eine spezifische Behandlung (Allopurinol 15 mg/kg/24 h/p.o.) durchgeführt. Die Behandlung wurde im November 2019 nach 3 Monaten Behandlung überwacht. Es wurden bilaterale Nephropathie mit Hydronephrose, mesenteriale Lymphadenomegalie und Aszites beobachtet. Die Blutbilduntersuchung ergab eine Abnahme der weißen Blutkörperchen und eine Abnahme der Thrombozyten bei der Leishmania-positiven Otter. Das biochemische Profil des Serums der Leishmania-positiven Otter zeigte Hyperproteinämie, Hyperglobulinämie, eine Abnahme von PON-1 und eine Erhöhung von Haptoglobin und Ferritin. Die Urinanalyse ergab eine Proteinurie und eine Abnahme der Osmolarität und des spezifischen Gewichts. Die Anwesenheit von anti-Leishmania-IgG2-Antikörpern und ein positives Ergebnis durch RT-PCR im Vollblut und im Knochenmark wurden bei der Leishmania-positiven Otter festgestellt. Die Sequenzierung der positiven Proben bestätigte die Identifizierung von L. infantum. Die amplifizierte Sequenz wies eine 100%-ige Ähnlichkeit mit einer Referenzsequenz von L. infantum auf. Außerdem wurden ovale Mikroorganismen mit einem exzentrischen Kern, der mit Leishmania spp. -amastigoten kompatibel ist, in der Zytologie der Milz beobachtet.