Eine 52-jährige Frau mit Cholezystektomie und partieller Resektion des linken Leberlappens im Jahr 2004 aufgrund symptomatischer Gallensteine und mehrfacher intrahepatischer Gallenwegsleiden hatte intermittierende Fieber und progressive Gelbsucht seit Anfang November 2014. Eine Gallenwegsobstruktion und ein Verdacht auf hepatische hilare Malignität wurden durch die anschließende Ultraschalluntersuchung, die MRT-Cholangiopankreatographie (MRT-CP), die MRT und die Positron-Emissions-Tomographie-Computertomographie (PET-CT) festgestellt. Eine explorative Laparotomie wurde Ende November 2014 durchgeführt (zusätzliche Datei: Abbildung S1) und ergab eine schwere intraabdominale Adhäsion, einen Knoten (1 × 2 cm) mit verhärteter Textur im proximalen linken Leberlappen und disseminierte neoplastische Läsionen, die in den hilaren Bereich des gemeinsamen Leber-Darm-Kanals, das hepatoduodenale Ligament, die umliegenden Lymphknoten, die Leberarterie, die Portalvene und den Zöliakus-Achsenbereich eindrangen. Diese Befunde zwangen die Chirurgen, auf eine radikale Resektion zu verzichten. Aus dem gemeinsamen Duktus wurde eitriges Galle ausgetreten, und ein Schleimpfropf ragte aus der Wand des Gallenwegs hervor. Ausgedehnte neoplastische Läsionen wurden aus den vergrößerten Lymphknoten, dem Knoten im linken Leberlappen und dem Rand des gemeinsamen Leber-Darm-Kanals entfernt. Diese wurden pathologisch untersucht. Die Gallenwegsobstruktion wurde mit einem Gallenwegsentleerungsgerät gelöst. Die pathologischen Befunde ergaben, dass es sich bei dem Tumor um ein schlecht differenziertes Adenokarzinom mit Differenzierungsmärkern von Cholangozyten handelte. Außerdem wurde eine moderate EGFR-Expression in >90 % der Tumorzellen festgestellt. Diese Patientin wurde schließlich als fortgeschrittenen, nicht resezierbaren perihilaren CCA diagnostiziert. Fünf Wochen nach der palliativen Operation erhielt die Patientin eine vierwöchige Tomotherapie gegen das hilare Malignom (DT = 60 Gy/25 F), einen Zyklus systemischer Chemotherapie mit Albumin-gebundenem Paclitaxel allein wegen ihrer unerträglichen gastrointestinalen Toxizitäten und die Infusion von autologen zytokinfreien Killerzellen. Aufgrund der zunehmenden CA199-Werte wurde die PET-CT sofort nach Abschluss der Strahlentherapie erneut untersucht und zeigte eine neue metastatische hypermetabolische Läsion im hepatikus caudatus und vergrößerte Weichteile und metastasen im retroperitonealen Lymphknoten mit abnormalen standardisierten Aufnahmewerten (SUV) zwischen der Leber und dem Magen, wenn sie mit der PET-CT vor der Strahlentherapie verglichen wurden. Vier Wochen nach der Strahlentherapie wurde die Patientin in die CART-EGFR-Studie aufgenommen. Ihr Performance-Status war 1 gemäß den Kriterien der Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG). Während der Vorbereitung der CART-EGFR-Zellen entwickelte sie hohes Fieber, aggressive Gelbsucht und eine Obstruktion der Gallenwege, begleitet von einer kontinuierlichen Erhöhung von CA199 (von 100,5 auf 413,5 U/ml), einem aggressiven Anstieg des Gesamtbilirubins, des direkten Bilirubins und anderer entzündungsbedingter Enzymwerte der Gallenwege und wurde mit einem Breitbandantibiotikum und endoskopischer Stent-Implantation in den hepatischen Gallenwegen behandelt. Die Studien (ClinicalTrials.gov-Kennung NCT01869166, NCT02541370) wurden vom Institutional Review Board des chinesischen PLA General Hospital genehmigt. An den Studien war kein kommerzieller Sponsor beteiligt. Die eingeschriebenen Patienten gaben gemäß der Deklaration von Helsinki eine schriftliche Einwilligungserklärung ab. Die DNA-Sequenz des einsträngigen Fragment-Variablen (scFv)-Targets EGFR-Antigen wurde von JQ306330.1 (GenBank-Nummer) abgeleitet. Anti-EGFR scFv-CD137-CD3zeta CAR wurde generiert und in den pWPT-lentiviralen Backbone kloniert, wie von Feng et al. detailliert beschrieben. [] Der Konstrukte wurde durch DNA-Sequenzierung verifiziert. Ein pseudotypisierter, klinischer Lentiviraler Vektor wurde durch Standard-transiente Transfektion, wie von McGinley et al. beschrieben, hergestellt. [] Gemäß den Anweisungen des Herstellers für Lipofectamine 3000 Transfektionsreagenz (Invitrogen, USA) wurden pWPT-anti-EGFR CAR-Plasmid, ps-PAX2-Verpackungsplasmid und pMD2.G-Hülle-Plasmid in 293 T-Zellen transfiziert. Die Lentiviralen Überstände wurden gesammelt und bei -80 °C gelagert. Der GFP-CD137-CD3zeta-Vektor wurde konstruiert, um die Transduktions-Effizienz mittels FACSCalibur-Durchflusszytometrie (BD Biosciences) zu verifizieren. Die DNA-Sequenz von scFv, die CD133-Antigen als Ziel hat, wurde von HW350341.1 (GenBank-Nummer) abgeleitet. Die Generierung, Konstruktion und Prüfung von CART-EGFR-T-Zellen verlief nach dem gleichen Verfahren wie bei CART-EGFR-Zellen (Zusatzdatei: Abbildung S2). CART-Zellen wurden aus autologen mononuklearen Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) hergestellt, die in Zellsammelröhren (BD Biosciences, San Jose, CA) gesammelt und aus 80 bis 100 ml Vollblut in der Good Manufacturing Practice Facility des chinesischen PLA General Hospital gemäß den aktuellen Standardarbeitsverfahren gereinigt wurden. PBMCs wurden mit 50 ng/ml anti-CD3-MoAb (Takara, Japan) und 500 U/ml rekombinantem humanem Interleukin-2 (Peprotech, USA) in GT-T551-Medium (Takara) stimuliert. Die lentivirale Transduktion wurde in GT-T551-Medium mit Protaminsulfat (Sigma) für 24 h nach 2 Tagen T-Zell-Kultur durchgeführt. Danach wurden die Zellen in Kulturbeuteln (Takara) weiterverarbeitet und als CART-Zellen geerntet. Bakterien, Pilze und Endotoxin wurden vor der Infusion von CART-Zellen getestet. Der Immunophenotyp von CART-Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern, die spezifisch für CD3, CD4, CD8, CD45RO, CD62L und CCR7 sind, analysiert. Für die Kontrollfärbung wurden isotyp-passende monoklonale Antikörper (BD Biosciences) verwendet. Die CART-Expression wurde mittels Durchflusszytometrie bei allen Patienten in derselben Charge auf GFP-CD137-CD3zeta-transduzierte Zellen geschätzt. Die Datenerfassung und -analyse wurde mit einer Durchflusszytometrie FACSCalibur (BD Biosciences) durchgeführt. Die in vitro-Zytotoxizität von CART-EGFR-Zellen wurde durch die Kokultur mit EGFR-positiven Tumorzellen in verschiedenen Effektor-Ziel-Verhältnissen in 96-Well-Platten mit einem 4-h CCK-8 Detection Kit (DOJINDO, Japan) getestet. Die quantitative Real-Time-PCR (Q-PCR) wurde verwendet, um das Niveau des CAR-Fusionsgens gemäß einem zuvor beschriebenen Protokoll zu bestimmen.13 Ein 153-bp (Basenpaar)-Fragment, das Teile der CD8a-Kette und die angrenzende 4-1BB-Kette (5′-GGTCCTTCTCCTGTCACTGGTT-3′ (Vorwärtsprimer) und 5′-TCTTCTTCTTCTGGAAATCGGCAG-3′ (Rückwärtsprimer)) enthielt, wurde durch das ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems) amplifiziert. Beta-Actin wurde als interne Kontrolle verwendet. Eine 7-Punkte-Standardkurve, die aus 100 bis 108 Kopien/μl Plasmid-DNA mit dem CAR-Gen bestand, wurde erstellt. Serum IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-12/IL23p40, IFN-γ, TNF-α, VEGF und Granzyme B wurden mit einem BD Biosciences Microbead-Sandwich-Immunoassay gemäß den Anweisungen des Herstellers getestet. Gemäß dem zuvor beschriebenen Kultursystem wurden CART-EGFR-Zellen aus den mononukleären Zellen von 80-100 ml des peripheren Blutes des Patienten generiert und für die Infusion freigegeben. Von den infundierten Zellen während des ersten Zyklus der CART-EGFR-Therapie waren 99,14 % CD3+-Zellen, die hauptsächlich aus der CD8+-Untergruppe (62,26 %) bestanden, und 23,61 % wurden mit dem zentralen Gedächtnisphänotyp (CD45RO+/CD62L+/CCR7+) gekennzeichnet. Außerdem waren 8,99 % der infundierten Zellen EGFR-positiv. Der Phänotyp und die Transfektionseffizienz der infundierten CART-EGFR-Zellen in jedem Zyklus sind in Tabelle 1 dokumentiert. CART133-Zellen wurden generiert und gemäß dem gleichen Verfahren wie CART-EGFR-Zellen kultiviert. Von den infundierten Zellen waren 95,2 % CD3+-Zellen, die hauptsächlich aus der CD8+-Untergruppe (71,9 %) bestanden, und 41,9 % waren CD45RO+/CD62L+/CCR7+-Untergruppe. Außerdem waren 6,4 % der infundierten Zellen CD133-positiv. Einzelheiten sind in der Tabelle dokumentiert. Aufgrund der kürzlich abgeschlossenen Strahlentherapie innerhalb von 2 Monaten und der Unverträglichkeit gegenüber chemotherapeutischen Mitteln erhielt die Patientin 4-tägige aufeinanderfolgende Infusionen von 2,2 × 106/kg CART-EGFR-Zellen insgesamt ohne Vorbehandlung und erreichte in der ersten Untersuchung 6 Wochen später einen PR, der gemäß Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Version 1.1 (RECIST 1.1) mit MRT und PET-CT bewertet wurde und eine Schrumpfung der metastatischen Läsionen in der Leberhilusregion und im kaudalen Lappen um mehr als 80 % sowie einen bemerkenswerten Rückgang der SUV zeigte. Die Kopienzahl des CAR-Transgens im peripheren Blut der Patientin erreichte einen Höchstwert von 5916 pg/dl am 9. Tag, begleitet von der Freisetzung von Zytokinen wie Interleukin-6 (IL-6) und C-reaktive Protein (CRP). Die zweite Monotherapie mit CART-EGFR wurde mit einer Dosis von EGFR-CAR+ exprimierenden T-Zellen von 2,1 × 106/kg und ohne Vorbehandlung verabreicht, da die Kopienzahl des CAR-Transgens im peripheren Blut 2 Monate nach der ersten Infusion von CART-EGFR-exprimierenden genetisch veränderten T-Zellen auf den Ausgangswert zurückging. Die routinemäßigen MRT- und PET-CT-Untersuchungen zeigten einen anhaltenden PR, begleitet von einem weiteren Rückgang von CA199 auf 61,2 U/ml. Interessanterweise erreichte der Höhepunkt der Kopienzahl des CART-EGFR-Transgens nach der Infusion des zweiten Zyklus von CART-EGFR-Zellen nicht den parallelen oder höheren Wert wie bei der ersten Infusion von CART-EGFR-Therapie. Der PR-Status der Patientin wurde 8,5 Monate lang aufrechterhalten, bis sie im November 2015 häufig unkontrollierbares Erbrechen, dumpfe Schmerzen im Oberbauch und Magensäure-Reflux entwickelte, die Mitte November 2015 auftraten. Die anschließende elektronische Gastroskopie zeigte eine Verengung der Duodenalbulb und die PET-CT bestätigte die Tumorprogression mit Darstellung mehrerer neuer abnormaler SUV-Läsionen im Omentum majus, Peritoneum und Bauchhöhle. Anschließend wurde die Patientin mit 1 Zyklus der CART-EGFR-Therapie in Kombination mit 2 Zyklen des monoklonalen Anti-PD-1-Antikörpers (Nivolumab, Bristol-Myers Squibb) behandelt, der in einer Dosis von 100 mg alle 2 Wochen verabreicht wurde. Ebenso erreichte die Anzahl der CAR-Transgene, die im peripheren Blut überwacht wurden, nicht den ähnlichen Spitzenwert der Infusion des ersten Zyklus, selbst in Kombination mit dem Anti-PD-1-Antikörper. Obwohl das Serum CA199 vorübergehend von 326,3 auf 210,8 U/ml sank, wurden im folgenden PET-CT neu aufgetretene Metastasen im Unterbauch, im rechten Leberlappen und im linken supraklavikulären Lymphknoten sowie eine Vergrößerung der vorherigen Tumorläsionen im Abdomen festgestellt, wenn man sie mit dem PET-CT vor der kombinierten Immuntherapie vergleicht. Da mehr als 90 % der Tumorzellen CD133-Protein (Zusatzdatei: Abbildung S3) exprimierten, wurde die Patientin dann in die CART133-Studie aufgenommen und erhielt die Infusion von 1,22 × 106/kg CD133-spezifischen CART-Zellen ohne konditionierende Behandlung. Aufgrund des Auftretens einer Obstruktion im absteigenden Duodenum und der daraus resultierenden persistierenden schweren Infektion der Gallenwege sowie eines Leberabszesses, die das Niveau von Serum CA199 beeinflussen und mit Antibiotika behandelt wurden, wurde die geplante Bildbewertung 2 Monate nach der Infusion von CART133-Zellen aufgeschoben, wobei die kontrastverstärkte CT eine bemerkenswerte Schrumpfung oder sogar das Verschwinden einiger Metastasen im Peritoneum und in der Bauchhöhle zeigte, was zu einer Bewertung von PR führte (Abb. ). Die CAR-Transgenkopiezahl im peripheren Blut (PB) schwankte zwischen 377 und 919 pg/dl (Abb. ). Die Patientin verspürte 2,5 Monate später anhaltend dumpfe Schmerzen im Oberbauch, und die anschließende CT-Untersuchung ergab eine neue metastatische Läsion von etwa 40 × 70 mm unter der Bauchdecke und vermutete Metastasen in der Bauchhöhle, begleitet von einer CAR-Transgenkopiezahl im PB, die nahe am Ausgangsniveau lag, was zu dem Schluss führte, dass es sich um eine progressive Erkrankung (PD) handelte (Abb. ). Unerwünschte Ereignisse wie Schüttelfrost, Fieber, Müdigkeit, Erbrechen und Muskelschmerzen, die während der Infusion von CART-EGFR-Zellen auftraten, waren in der Regel mild, tolerierbar und ließen sich durch unterstützende Pflege bewältigen. Allerdings entwickelte die Patientin ab dem dritten Tag nach der CART-Zellinfusion ein neun Tage andauerndes, niedriges Fieber ohne Schüttelfrost, Husten, Diarrhoe oder andere infektiöse Symptome. Die wiederholte Laboruntersuchung der PB ergab einen normalen Leukozytenwert, neutrophile Ratio, negative Procalcitonin (PCT) und Blutkulturen, die die Diagnose einer Infektion nicht stützten, aber eine Eskalation von IL-6 und CRP und einen akuten Anstieg von glutamic-pyruvic transaminase und glutamic-oxalacetic transaminase (>6ULN) zeigten. Zwei Wochen nach der Infusion des ersten Zyklus von CART-EGFR-Zellen erschienen einige verstreute kleine Ausschläge am linken Oberschenkel, die sich allmählich verschlechterten und sichtbar und juckend wurden, mit dem Auftreten mehrerer schuppiger oder linearer Ausschläge, die sich vom linken Oberschenkel bis zum Wadenbein ausbreiteten und zusammenflossen, was nach den gemeinsamen Terminologie-Kriterien für unerwünschte Ereignisse 4.0 (CTCAE 4.0) als Grad 2 eingestuft wurde, als der zweite Zyklus der CART-Immuntherapie abgeschlossen war. Die Ausschläge wurden mit einer Biopsie unter Illustration der lichenartigen pathologischen Veränderungen, wie dem Verlust von partieller Epidermis, vakuolärer Degeneration der Basalzellen und Infiltration zahlreicher T-Lymphozyten in der Epidermis und ihren Anhängseln, erfolgreich mit Tacrolimus-Salbe behandelt. Während der CART-EGFR-Behandlung trat keine Hypotension auf. Neben leichten Übelkeit, Erbrechen, Schüttelfrost, Fieber und Müdigkeit traten im Verlauf der kombinierten Behandlung keine anderen akuten Nebenwirkungen auf. Obwohl nach der kombinierten Immuntherapie Schuppenbildung auftrat und sich verschlimmerte, waren keine medizinischen Eingriffe erforderlich. Die Serumspiegel von Zytokinen wie Tumornekrosefaktor α (TNF α), IL-6 und CRP stiegen leicht an und führten zu keinen Symptomen der Zytokinfreisetzung. Während der Infusion von CART133-Zellen in aufeinanderfolgenden, steigenden Dosen über 4 Tage, traten keine anderen unerwünschten Ereignisse auf, mit Ausnahme von leichten, infusionsbedingten Fieber und Müdigkeit. Am zweiten Morgen nach der Infusion von CART133-Zellen, entwickelte diese Patientin jedoch intermittierende, oberflächliche, dumpfe Schmerzen im Oberbauch, Schüttelfrost, Fieber (39,1 °C), sporadische, punktförmige Blutungen und kongestives Hautausschlag auf ihren Waden, die sich schnell und diffus auf ihren Nacken, den rechten Oberarm, die Brust, den linken Unterleib und die retro pharyngeale Schleimhaut ausbreiteten, begleitet von Pruritus und Diarrhoe am Nachmittag und einer weiteren Verschlechterung in den folgenden 10 Tagen. Die unerwünschten Ereignisse auf der Haut und unter der Haut wurden mit 3 nach CTCAE 4.0 eingestuft. Die serielle Serum-Zytokin-Untersuchung ergab eine schnelle Erhöhung von TNF-α, IL-6 und CRP. Etanercept, ein Fusionsprotein, das als TNF-Inhibitor wirkt, intravenöses Methylprednisolon und Gamma-Globulin wurden sofort verabreicht und kehrten die Haut-/Mukosatoxizitäten erfolgreich um. Die Verwendung von CAR-modifizierten T-Zellen zur Bekämpfung von Krebserkrankungen wird seit mehr als 20 Jahren untersucht. Bis vor kurzem führte CART19 zu vielversprechenden Ergebnissen bei CD19-exprimierenden hämatologischen Malignomen. Wie dieser aufregende Erfolg der CART-Therapie auf solide Tumore übertragen werden kann, blieb jedoch unklar und erforderte ein besseres Verständnis der potenziellen therapeutischen Barrieren, einschließlich Faktoren, die die CART-Zellimpfstoff-Expansion, -Persistenz und -Verkehr in vivo, das Tumormikroumfeld und seine Interaktion mit Tumorzellen sowie Krebsstammzellen und die Aufbereitungstherapien regulieren. Wie Porter et al. hervorgehoben haben, ist die starke Expansion und Persistenz von CART-Zellen in vivo ein entscheidender Faktor für die therapeutische Wirksamkeit. In diesem Fall stieg die Anzahl der CART-EGFR-Transgene in PB unmittelbar nach dem Beginn der CART-EGFR-Zellinfusion auf den Spitzenwert, was zeigt, dass CART-EGFR-Zellen in vivo eine robuste Expansion durchlaufen, was eine der Voraussetzungen dafür ist, dass CART-EGFR-Zellen EGFR-exprimierende CCA-Zellen eliminieren. Außerdem wurde die Persistenz von CART-Zellen in vivo trotz einer Reihe möglicher Störfaktoren, wie z. B. CAR-Affinität für das Ziel, CAR-Immunogenität und Faktoren, die vom Wirt stammen, als direkt korreliert mit einer längeren Zeit bis zur Progression angesehen. Dieser Patient wurde mit der zweiten Zyklusinfusion von CART-EGFR-Zellen behandelt, sobald die CART-EGFR-Transgene in PB auf den Ausgangswert zurückgingen, was die effektive Persistenz von CART-Zellen in vivo für mehr als 24 Wochen und den PR-Status des Patienten für 8,5 Monate ermöglicht hat. Dies könnte darauf hindeuten, dass wiederholte Infusionen von CART-Zellen dazu beitragen können, ihre Persistenz in vivo zu verlängern und ein längeres progressionsfreies Überleben unter Bedingungen zu ermöglichen, unter denen der Zieltumor auf CART-EGFR-Zellen ansprach. Gleichzeitig stellten wir fest, dass die CART-Transgene in den nachfolgenden Zyklen der CART-Zellinfusion nicht parallel oder höher als der Spitzenwert waren, selbst in Kombination mit dem Anti-PD-1-Antikörper, verglichen mit dem des ersten Zyklus. Dies deutet auf eine schwächere Expansion von CART-Zellen in vivo und den Verlust von CART-Zellen hin. Ein möglicher Mechanismus ist, dass das in das CART-Transgene integrierte murine scFv zur Entwicklung einer CD8+ T-Zell-Immunität führen kann. Die ultimative funktionelle Kompetenz von CART-Zellen in soliden Tumoren wird dadurch bestimmt, ob sie effektiv in die Tumormikroumgebung eindringen können, ein komplexes und dichtes Netzwerk aus fibrotischen Matrizen, das von beiden, malignen und nicht-malignen Zellen orchestriert wird, in dem die infiltrierten CART-Zellen durch immunsuppressive Zellen und Moleküle wie Tregs, myeloide suppressive Zellen (MDSCs) und den programmierten Zelltod-Proteinliganden 1 (PD-L1) gehemmt werden können, was zu einem schnellen Verlust ihrer zytolytischen und zytokinspezifischen Kapazität und zu einem Zustand der Hyporesponsivität führt.[] Außerdem weisen solide Tumore häufig metabolische Abweichungen auf, indem sie wichtige Aminosäuren, die für die T-Zellaktivität entscheidend sind, übermäßig verbrauchen und eine Hypoxie und daraus resultierende Säuerung der extrazellulären Matrix aufgrund unzureichender vaskulärer Versorgung hervorrufen, die für das Überleben der T-Zellen feindselig ist.[] Daher ist eine Modulation des Tumormikroumfelds notwendig, um die Ergebnisse zu verbessern. In diesem Fall wurde die Patientin trotz der Tatsache, dass sie keine direkte konditionierende Behandlung mit dem Ziel der Transformation des Tumormikroumfelds erhielt, vor der Immuntherapie mit einem Abstand von etwa einem Monat mit 60 Gy Strahlentherapie behandelt. Obwohl die Strahlentherapie selbst nicht dazu führte, dass Tumorzellen effektiv ausgerottet wurden, können ihre direkten und verzögerten Effekte eine Zerstörung des tumorunterstützenden Stromas, eine Veränderung der Biologie des Tumormikroumfelds, eine Förderung der Freisetzung weiterer tumorassoziierter Antigene und eine verstärkte Immunerkennung bewirken.[] Außerdem könnte die Strahlentherapie Tumore immunogen machen und anfälliger für einen verbesserten Angriff durch die Immunzellen machen [], und sogar antitumorale Effekte in jenen entfernten Metastasen erzeugen, die nicht lokal bestrahlt wurden (auch als abszopaler Effekt bezeichnet) [, ]. Wir stellen daher die Hypothese auf, dass Strahlentherapie eine vernünftige und effektive konditionierende Therapie zur Verbesserung der Ergebnisse der CART-Therapie sein könnte. Als der Widerstand gegen die CART-EGFR-Therapie bestätigt wurde, probierten wir einmal eine Kombination aus Immuntherapie mit Anti-PD-1-Antikörpern und CART-EGFR-Zellinfusion auf der Grundlage einer präklinischen Studie, bei der die Blockade der PD-1-Immunsuppression die therapeutische Wirksamkeit der CART-Zelltherapie gegen etablierte solide Tumore deutlich erhöhen konnte. [] Leider endete diese Behandlung mit einem Fehlschlag, da die PET-CT die Progression der Erkrankung bestätigte, obwohl CA199 vorübergehend verringert war. Eine mögliche Erklärung ist der unklare Grad der PD-L1-Expression. In letzter Zeit wird die PD-L1-Expression aufgrund ihres Werts bei der Vorhersage der therapeutischen Effekte von Anti-PD-1-Medikamenten hervorgehoben. Die Tumorläsion war jedoch in diesem Fall aufgrund ihrer anatomischen Lage für eine Biopsie schwierig, sodass der Grad der PD-L1-Protein-Expression auf Tumorzellen vor dem Beginn der Anti-PD-1-Therapie nicht genau erkannt werden konnte, was die Möglichkeit mit sich bringt, dass die PD-L1-Expression im Tumormilieu niedrig oder sogar negativ ist und daher zu einem Fehlschlag der Anti-PD-1-Therapie führt. In dieser Situation war die Auswahl eines rationalen Ziels für den nächsten Schritt der Behandlung der Patienten von entscheidender Bedeutung. Kürzlich haben die CSCs in CCA große Aufmerksamkeit aufgrund ihrer hochkarzinogenen Eigenschaften und ihrer Schlüsselrolle bei der Vermittlung der Selbsterneuerung, des Tumorwachstums und der therapeutischen Resistenz auf sich gezogen. Folglich ist eine Therapie, die auf die Oberflächenmolekülmarker und Signalwege, die spezifisch für CSCs sind, abzielt, eine mögliche starke Option für CCA [, ]. Unter diesen Umständen ist die Auswahl eines rationalen Ziels für den nächsten Schritt der Behandlung der Patienten von entscheidender Bedeutung. Kürzlich haben Shien und Kollegen berichtet, dass CD133-positive Tumorzellen eine größere Resistenz gegen die postoperative Behandlung aufwiesen als CD133-negative Zellen, und eine erhöhte CD133-Expression wurde in den restlichen Krebszellen nach einer adjuvanten Therapie beobachtet. [] Basierend auf den oben genannten Informationen haben wir schließlich CD133 als das Zielantigen für die CART-Immuntherapie ausgewählt, was wiederum eine weitere Teilerantwort und die Demonstration, dass CART-Cocktail-Immuntherapie machbar und rational ist, hervorbrachte. Ein weiterer wichtiger Aspekt war die Toxizität, die durch CART-EGFR-Zellen auf die Zielantigene, die auf Tumorzellen und/oder synchron auf normalen Geweben exprimiert werden, hervorgerufen werden kann. Diese Toxizität wird als „on-target off-tumor effect“ bezeichnet. Die Schädigung normaler Gewebe kann sogar durch eine unerwartete Kreuzreaktion mit einem Protein verursacht werden, das auf Tumorzellen nicht exprimiert wird. Seit Beginn der CART-EGFR-Zellinfusion erlitt dieser Patient nicht nur Fieber, Schüttelfrost und Müdigkeit, sondern auch anhaltende Pyrexie, einen akuten Anstieg der Serumtransaminasen und verzögert auftretende Hautausschläge, die von einem robusten Anstieg der CAR-Transgene, von IL-6 und CRP begleitet wurden, obwohl die Werte dieser Parameter nicht die Kriterien für die Diagnose eines Zytokinfreisetzungssyndroms erfüllten [, ]. Die massiven Zytokine, die direkt durch die infundierten CART-Zellen produziert werden, spiegelten eine starke Immunantwort wider, die sowohl antitumorale Effekte auf Tumorzellen als auch Nebenwirkungen auf normale Gewebe erzeugen konnte. Außerdem war der on-target off-tumor-Effekt, der durch CART-EGFR-Zellen verursacht wurde, wahrscheinlich der Grund für die Auslösung von dermaler Toxizität aufgrund der Verteilung von EGFR auf der Epidermis []. Allerdings waren alle diese Nebenwirkungen mild, reversibel und wurden durch unterstützende Pflege und topische Kortikosteroide behandelt. Die Zugabe von anti-PD-1-Antikörpern verschlimmerte offenbar nicht die Toxizität der CART-EGFR-Immuntherapie in diesem Fall. Dennoch kam es bei der anschließenden Behandlung mit CART133-Zellinfusion zu schweren dermatologischen, oralen mukosalen und gastrointestinalen Toxizitäten, wie z. B. kongestiven Hautausschlägen und Blutungen. Obwohl diese Toxizitäten erfolgreich durch dringende medizinische Maßnahmen, einschließlich intravenöser Verabreichung von Methylprednisolon und Anti-TNF-Inhibitor, behandelt wurden, könnte der inhärente Mechanismus weitgehend auf den on-target off-tumor-Effekt von CART133-Zellen zurückzuführen sein, die auf das CD133-Antigen abzielen, das auf normalem Epithel und vaskulärem Endothel exprimiert wird. Gleichzeitig war es unklar, ob die anti-PD-1-Antikörper und die CART-EGFR-Zellen in vivo eine Rolle bei der Verschlechterung der Toxizität der CART133-Immuntherapie spielen könnten.