Eine 47-jährige Frau (Gewicht: 62 kg) wurde 1996 mit chronischer aktiver HBeAg-positiver Hepatitis B diagnostiziert. Virale Parameter wie HBeAg, anti-HBe IgG und HBV-Plasma-Viruslast aus gefrorenen Proben wurden gleichzeitig von einem einzigen Bediener gemessen, um intra- und interassay-Variationen zu reduzieren. HBeAg und anti-HBe wurden durch Elektrochemilumineszenz (ELECSYS 2010, Roche Diagnostic) bestimmt. HBV-Viruslast-Level wurden durch Real-Time-PCR (COBAS TaqMan Roche Molecular Systems, dynamischer Bereich 30 IU/ml bis 110.000.000 IU/ml) bestimmt. [] Leberentzündung wurde durch Serum-Alanin-Aminotransferase (ALT)-Level gemessen. Für die Sequenzanalyse wurden HBV-Pol- und PreC-Core-Gene mit den zuvor beschriebenen Primern sequenziell sequenziert. Die Analyse wurde mit einem ABI3100-Instrument (Applied Biosystems) durchgeführt, und die in dieser Arbeit eingeführten Sequenzen sowie die aus der GenBank-Datenbank erhaltenen Sequenzen wurden mit ClustalX v1.83 [] abgeglichen und mit Bioedit v7.0.9.0 [] bearbeitet. Der HBV-Genotyp wurde mit der phylogenetischen Inferenz unter Verwendung des Neighbor-joining-Algorithmus mit dem Kimura-Zwei-Parameter-Modell der molekularen Evolution in der MEGA v3.1-Software [] bewertet. Sequenzen aus beiden Genen wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten während der antiviralen Therapie erhalten (Abbildung). Eine detailliertere HBV-Pol-Gen-Klonanalyse wurde an sieben ausgewählten viralen Isolaten aus Serumproben durchgeführt, die während der sequentiellen Therapien gesammelt wurden. Jedes ausgewählte PCR-Produkt des Pol-Gens wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers (Promega, Wisconsin, USA) in den pGEM-T Easy-Vektor kloniert, und mindestens 15 Klone wurden durch Sequenzierung weiter analysiert. Dies ermöglichte die Analyse der Entwicklung der viralen Quasispecies unter dem aufeinanderfolgenden antiviralen Druck auf der Grundlage der Analyse des Pol-Gens. Die anti-HBV-Behandlung mit HBV-Viralbelastung und ALT-Wert-Kinetik ist in der Abbildung dargestellt. Die Therapie wurde eingeleitet, als die HBV-Viralbelastung auf 6,5 × 106 IU/ml anstieg. Im Jahr 1998, als der Patient mit IFN-alpha 5 MU dreimal wöchentlich über 30 Wochen behandelt wurde, lag der HBV-DNA-Wert unterhalb der Nachweisgrenze. Die Therapie wurde unterbrochen und im Jahr 1999 durch Lamivudin (150 mg einmal täglich) ersetzt. Nach 2 Jahren kontinuierlicher Behandlung war HBV-DNA nachweisbar (15,5 × 106 IU/ml). HBeAg blieb während dieser Behandlungszeit negativ mit nachweisbaren anti-HBe. Im Jahr 2001, nach einer 6-monatigen Unterbrechung, zeigte der HBV-DNA-Wert einen Anstieg nach der Behandlung (1 × 108 IU/ml). Am Ende des Jahres 2003 wurde die Lamivudin-Therapie wieder eingeführt (150 mg einmal täglich). Sie ging mit einem seltenen Ereignis einher, bei dem es zu einer Rückkehr zu einem HBeAg-positiven/anti-HBe-negativen Profil kam, das zwei Jahre lang nachweisbar blieb. Die Viruslast erreichte zu diesem Zeitpunkt 3,1 × 106 IU/ml. Zehn Monate später, im Jahr 2006, wurde das Lamivudin-Regime durch eine Adefovir-Monotherapie (10 mg/Tag) ersetzt. Die Viruslast lag zunächst niedrig (8,5 × 104 IU/ml), aber nach 48 Wochen Therapie erreichte sie 7,15 × 106 IU/ml. Die ALT-Werte waren in diesem Intervall normal. Die Reaktivierung der HBV-Replikation wurde aufgrund der gleichzeitigen Erkennung von HBeAg/anti-HBe [] und der hohen Replikation angenommen. Das Vorkommen von HBeAg und anti-HBe scheint unter antiviral behandlungsnaiven Patienten nicht ungewöhnlich zu sein, aber seine Prävalenz unter behandelten Patienten ist nicht bekannt. Dieses serologische Muster wurde mit einer extensiven Hepatozyten-Schädigung und einer schweren immunvermittelten Leberschädigung und daraus resultierenden Funktionsstörungen in Verbindung gebracht. [] Sechs Monate später stieg der ALT-Wert leicht an (1,5 × obere Normgrenze - UNL -), und es wurde eine Entecavir-Monotherapie (1 mg täglich) eingeleitet. Nach einer 5-monatigen Entecavir-Monotherapie wurde die Behandlung mit Tenofovir (300 mg einmal täglich) als Doppeltherapie hinzugefügt. Die HBV-DNA sank vier Monate lang auf 1 × 105 IU/ml, aber drei Monate später erreichte die Viruslast > 1,1 × 108 IU/ml. Außerdem deutete ein Anstieg der ALT-Werte (20-facher ULN) auf eine Leberentzündung hin. In den folgenden 48 Wochen sank die Virusreplikation leicht auf 6,1 × 106 IU/ml, aber sie stieg erst auf 3,6 × 107 IU/ml und später auf > 1,1 × 108 IU/ml. In jüngerer Zeit (zweites Halbjahr 2010) schwankten die HBV-DNA-Werte zwischen 4,3 × 104 IU/ml und 4,9 × 107 IU/ml. Am Ende der Studiennachbeobachtung konnten wir die Tenofovir-Konzentration im Plasma mit Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie in drei aufeinanderfolgenden Proben 20 Stunden nach der Verabreichung messen, wobei sie 71,6 ng/ml ± 47,6 (Mittelwert ± SD) erreichte. Die ALT-AST-Werte blieben in den letzten zwei Jahren der Nachuntersuchung leicht erhöht (2× UNL). HBV-Isolate aus dem Patienten wurden dem Genotyp A2 zugeordnet, basierend auf der phylogenetischen Verwandtschaft zwischen den partiellen HBV-Genomequenzen aus beiden Pol- und PreC-C-Genen. Eine weitere genotypische Langzeitanalyse, einschließlich der Quasispecies-Zusammensetzung der HBV-Stämme, die aus dem Patienten isoliert wurden, ergab das Vorhandensein von Resistenzmutationen, die auf die Pol-Gensequenz zurückzuführen sind (Tabelle). Zu Beginn der Lamivudin-Therapie war HBV in allen Klonen wild-typ. Nach 2 Jahren unter einer solchen Therapie wurde diese Viruspopulation vollständig durch die rtM204I-Mutation ersetzt, die homogen Lamivudin-resistent war. Als die Therapie für 6 Monate unterbrochen wurde, bestand die Quasispecies-Zusammensetzung fast ausschließlich aus Wildtyp-Pol-Nukleotidequenzen, mit Ausnahme eines kleinen Beitrags (< 10%), der die adefovir-resistente I233V-Mutation aufwies. Sobald die Lamivudin-Therapie wieder aufgenommen wurde und bis zur Verabreichung von Entecavir plus Tenofovir, wurden die dualen Lamivudin-resistenten rtL180M- und rtM204I-Mutationen immer wieder nachgewiesen. Unter dem letzteren therapeutischen Schema wurden die A181T- und T184L-Lamivudin-Adefovir- und Entecavir-resistenten Mutationen jeweils nur ephemer und mit geringem Beitrag (< 5%) nachgewiesen. Zusätzlich wurden zwei weitere Varianten im katalytischen Bereich der Reverse-Transkriptase zum Zeitpunkt der Lamivudin-Resistenz erkannt. Diese rtA200V- und rtI253V-Varianten waren auch während der Entecavir-Therapie vorhanden und wurden auch in Proben erkannt, die nach einem Durchbruch während der Entecavir-Therapie sequenziert wurden. Die genomische HBV-Charakterisierung auf PreC-C-Ebene zeigte das Vorhandensein der Doppelmutation A1762T und G1764A, die früh erkannt wurde, als der Patient nicht behandelt wurde und in diesem Zustand während der gesamten Nachbeobachtung blieb. Die T1753C-Mutation wurde ebenfalls konsequent erkannt. Das Vorhandensein dieser Kernpromotor-Mutationen steht auch mit dem oben erwähnten HBeAg-antiHBe-Konkurrenzprofil in Verbindung, das bei diesem Patienten gefunden wurde, wie kürzlich berichtet wurde [].