Patienten er en pige, nu 11 år, født tre uger for tidligt ved kejsersnit på grund af tværgående stilling, fødselsvægt 2720 g. Der var ingen fodringsvanskeligheder i barndommen eller senere. Motorisk og sproglig udvikling var forsinket: hun gik uden støtte i en alder af 2½ år, og i en alder af 3 år sagde hun sine første ord. I en alder af 10 år kendte hun alfabetet og prøvede at sætte bogstaver sammen. Hun brugte bleer indtil en alder af 8-9 år. Hendes søvnmønster er mildt irregulært med hyppige opvågninger. Medfødte misdannelser eller epilepsi er aldrig blevet opdaget. Hun har normal statur med længde langs 25.-50. centil og vægt langs 25. centil, men hendes hovedomfang har været i det nedre normale område (2,5.-5. centil). Hendes ansigtstræk er også normale - hun er ikke klart dysmorfisk. Adfærden er normal uden autistiske træk, men bruxisme er et problem. Hun foretrækker selskab med yngre børn. Hendes intellektuelle niveau vurderes at være sammenligneligt med mild-moderat ID, formel IQ-testning er endnu ikke blevet gjort. I en alder af 9 år afslørede trio hele exome sekventering (WES), der sammenligner barnets og forældrenes DNA-sekvenser, en de novo NAA10 (NM_003491.3) c.332 T > G p.V111G variant, som blev yderligere bekræftet ved Sanger sekventering. I overensstemmelse med andre NAA10 missense varianter, påvirker V111G substitutionen en stærkt konserveret aminosyre. NAA10 er et 235 aminosyre protein, som tilpasser den karakteristiske GNAT fold fælles for NAT katalytiske underenheder. Denne fold består af seks eller syv β-strenge og fire α-helixer. β-strenge 2-5 udgør kernen af proteinet. Disse fire β-strenge, sammen med α2-helixen og β6-β7-løkken, som er vigtig for substratbinding, er stærkt konserverede. V111 er placeret mod slutningen af β5-strengen, og en valin i denne position er stærkt konserveret i NAA10 homologer samt i flere andre NAT katalytiske underenheder, for hvilke krystalstrukturer er blevet løst, 4U9W (NAA40), 3FTY (NAA50), 5ICV (NAA60) og 4LX9 (ssNAT)) [–]. Sidekæden af V111 danner en hydrofob lomme sammen med Y145, M147, L119 og L109. Den er også i tæt nærhed (3,7 Å) til svovlgruppen af acetyl-CoA (AcCoA), hvilket kunne indikere en rolle for V111 i positionering af AcCoA. En glycin i denne position vil ikke forårsage nogen sterisk konflikt, men tab af den mere voluminøse hydrofobe sidekæde af valin kan muligvis forårsage strukturelle ændringer, som påvirker proteinets stabilitet eller AcCoA-binding. For at funktionelt vurdere NAA10-V111G, udtrykte vi først His/MBP-NAA10-WT og His/MBP-NAA10-V111G i E. coli, oprensede enzymer og testede NAT-aktiviteten in vitro. I modsætning til His/MBP-NAA10-WT var det svært at opnå en god proteinudtryk af His/MBP-NAA10-V111G, og en væsentlig fraktion af de oprensede His/MBP-NAA10-V111G-molekyler eluerede i tom volumen af størrelseseksklusionskromatografikolonnen. Dette indikerer, at dele af proteinet aggregerer i enheder større end 200 kDa, sandsynligvis på grund af en ændring af proteinstrukturen eller reduceret proteinstyrke. Enzymer, der eluerede ved et kolonnevolumen svarende til monomerisk His/MBP-NAA10-V111G, blev testet for katalytisk aktivitet og viste sig at have en ca. 85 % reduktion i katalytisk aktivitet sammenlignet med His/MBP-NAA10-WT. På grund af det lave ekspressionsniveau og proteinudbytte af NAA10-V111G fra E. coli transfektion og proteinrensning, transfekterede vi HeLa-celler med plasmider, der koder for enten V5-tagged NAA10-WT eller V5-tagged NAA10-V111G efterfulgt af immunpræcipitering (IP) af det overeksprimerede protein ved hjælp af et anti-V5 antistof. Derefter blev NAT-aktivitet i præcipitatet målt. NAA10 og NAA15 danner et høj-affinitets proteinkompleks, og som forventet blev endogent NAA15 co-immunpræcipiteret med både overeksprimerede NAA10-WT-V5 og NAA10-V111G-V5. Mængden af NAA10 og NAA15 i hver prøve blev bestemt ved SDS-PAGE og Western blotting. Bånd fra Western blotting blev kvantificeret, og den målte katalytiske aktivitet blev korreleret med mængden af NAA10-V5 til stede i prøven (dvs. en blanding af monomerisk NAA10 og NAA10 i kompleks med NAA15 – NatA-komplekset), og blev separat korreleret med mængden af NAA15 til stede i prøven (dvs. mængden af NatA-komplekset alene). Resultaterne fra IP-aktivitetseksperimentet svarede godt til vores tidligere fund: NAA10-V111G's evne til at acetylerer den sure N-terminus EEEI24 var stærkt reduceret. Det afslørede dog også et andet interessant træk: Som det ses af Western blottet i Fig., blev mere NAA15 co-immunpræcipiteret med NAA10-V111G-V5 sammenlignet med NAA10-WT-V5. Dette blev også afspejlet i vores NAT-aktivitetsmålinger, hvor det immunpræcipiterede NAA10-V111G-V5-prøve viste højere NatA-produktionsdannelse (for NatA-substratpolypeptidet SESS24) sammenlignet med den immunpræcipiterede NAA10-WT-V5-prøve, når der blev korreleret med mængden af total NAA10-V5 til stede i prøven. Når der blev korreleret med mængden af NAA15 til stede i hver prøve, var NatA-produktionsdannelsen pr. NAA15-molekyle (og dermed NatA-kompleks) imidlertid omtrent lig. Da monomerisk NAA10 har en 1000 gange lavere NAT-aktivitet over for NatA-substrater sammenlignet med NatA-komplekset [], var bidraget fra monomerisk NAA10 til acetylering af SESS24 minimal. Alt i alt antyder dette, at NAA10-V111G har reduceret katalytisk aktivitet i en monomer form, men ikke i kompleks med NAA15. For at vurdere proteinomsætningen af NAA10-WT og NAA10-V111G udtrykte vi V5-tagged NAA10-WT og NAA10-V111G i HeLa-celler og udførte cycloheximide-chase-eksperimenter. Som det kan ses på fig., har NAA10-V111G-V5 en højere omsætningshastighed end NAA10-WT-V5. 2 timer efter cycloheximidebehandling var den gennemsnitlige mængde af NAA10-V111G-V5 reduceret med ca. 80 %, mens NAA10-WT-V5-molekyler blev reduceret med 20 % i forhold til mængden af NAA10-molekyler før cycloheximidebehandling. Selv om mængden af NAA10-V111G-V5 er drastisk reduceret efter 2 timer, synes niveauet af NAA10-V111G-V5 at stabilisere sig omkring 20 %. Mest sandsynligt er overudtrykt NAA10-V111G-V5 til stede i både en ustabil monomerisk form, der hurtigt nedbrydes, og i kompleks med NAA15, som stabiliserer enzymet og beskytter det mod nedbrydning.