En 74-årig mand blev henvist til sin praktiserende læge i august 2006 med klager over hukommelsestab og blev derefter henvist til en neurolog. Han viste et hurtigt globalt kognitivt fald forbundet med aggressivitet, bizar adfærd og tab af sprog. Dette blev ledsaget af svær anomi, disinhibition og en score på 10/30 på MMSE. Der var ingen fokale tegn, myoklonus eller ataxi. Den kliniske forværring var meget hurtig, og i december 2006 var han i et akinetisk-mutisme-lignende syndrom med unormal kropsholdning. To kraniel magnetisk resonans (MRI) i oktober og december 2006, herunder T1, T2, FLAIR og DWI sekvenser, viste moderate tegn på hjerneatrofi, men ingen stigning i unormale kortikale eller basale ganglier. Elektroencefalogram (EEG) var ikke-diagnostisk og protein 14-3-3 niveau i cerebrospinalvæsken (CSF) var normalt. Patienten døde i marts 2007. Familiehistorien om demens inkluderede en 80-årig bror diagnosticeret med sandsynlig Alzheimers sygdom. Der blev ikke fundet mutationer i den åbne læsningsliste efter sekventering af prionprotein-genet (PRNP). En heterozygose methioninvalin (MV) blev observeret i kodon 129. Moderate til milde svampelignende forandringer var til stede i neocortex, putamen/globus pallidus og thalamus, hvor læsionerne var mere tydelige i putamen og frontal cortex. Konfluente vakuoler blev ikke fundet i nogen region. Bortset fra nogle få fokale vakuoler i det dybere molekylære lag var cerebellum-cortexen ellers ikke bemærkelsesværdig. Neuroner var stort set bevaret i cerebellum-cortexen og basal ganglia, selv om fokale astrogliose sjældent blev observeret. Mild til moderat mikrogliose var til stede i cerebellum-cortexen og basal ganglia, og subcortical hvidt stof, henholdsvis. Immunofarvning af PrP uden proteinase K forbehandling viste stærk farvning karakteriseret ved fine punktformede aflejringer (synaptiske-lignende) og uregelmæssige granulære, ofte sammenflydende, aflejringer, der kunne kategoriseres som diffus synaptisk. Perineuronale og cerebellar plaque-lignende aflejringer, kuru plaque og floride plaque var fraværende. Efter PK-behandling forsvandt det meste af farvningen, bortset fra nogle få granulære PrP PK-resistente aflejringer. Cerebellum viste et diskret synaptisk-lignende mønster i molekylære og granulære lag, som forsvandt efter PK-forbehandling. Følsomhed over for PK-forbehandling blev bedst visualiseret i konsekutive sektioner med og uden PK-forbehandling. Parallelle sektioner farvet med 3F4 antistof viste en markant reduktion af PrP-immunreaktivitet, som blev evalueret ved densitometri, og involverede 70-80% af den samlede PrP i vævssnit. Dette blev yderligere bekræftet ved inkubation af vævssnit med 1E4 antistof og sammenligning af PrP-immunhistokemisk mønster af en sCJD MV1-sag med probanden. Som vist i figur, viste 3F4 og 1E4 synaptisk PrP-immunreaktivitet i den fælles MV1 sag resistent PrP-immunreaktivitet. I modsætning hertil blev 3F4 og 1E4 immunreaktivitet praktisk talt afskaffet efter PK-forbehandling i probanden. Udover disse ændringer var der neurofibrillære tangler og præ-tangler samt granuler (korn) i entorhinale og peri-rhinale cortices, subiculum og CA1 og CA3 regioner af hippocampus. Et par præ-tangler og korn blev også observeret i amygdala. Disse ændringer blev ledsaget af et par hyper-phosphorylerede tau-aflejringer i neuroner i dentate gyrus, snoede kroppe i den hvide substans i den tidsmæssige lobe og peri-ventrikulære astrocytter. Spredte αB-krystalliner-immunreaktive ballonede neuroner var til stede i den entorinale cortex og amygdala. Tau-patologi var i overensstemmelse med Alzheimers sygdoms fase III og argyrophilic grain disease fase 3. Amyloid plaques og α-synuclein inklusioner var fraværende. Ingen abnormiteter blev fundet med anti-TDP-43 antistoffer. Standard PrP Western-blot procedure (10% hjernehomogenat og endelig PK koncentration på 440 μg/ml) kunne ikke påvise PrPSc. Hvis man øger volumenet, der lægges i gelen, fra 5 til 10 μl, får man et ekstremt svagt signal, der svarer til 24 og 19 kDa under mættende filmeksponeringstider. Hvis man sænker PK koncentrationerne (440, 100 og 50 μg/ml), får man en stigning i PrPSc signalet, der antyder et PK-følsomt prionprotein. Selv da var der kun to bånd på 24 og 19 kDa, der var synlige. Efter at have øget procentdelen af hjernehomogenat til 20%, fik man det samme to-bånds mønster. Ved hjælp af TeSeE®-sættet, der er karakteriseret ved blødere PK-fordøjelsesbetingelser efterfulgt af trin til oprensning og koncentration af proteinet og farvning med Sha31 Mab, blev tilstedeværelsen af to uventede bånd på 21 og 16 kDa afsløret. Dette båndprofil blev observeret i alle hjerneregioner og udgjorde et slående resultat, da deres molekylvægt var forskellig fra den, der tidligere blev påvist med Mab 3F4 og 6H4. Udførelse af en kombination af fordøjelse, oprensning og koncentration af prøven i overensstemmelse med TeSeE®-sætets anbefalinger sammen med påvisning ved hjælp af 3F4 og 6H4 gav et nyt mønster. Ikke kun de tidligere bånd på 24, 21, 19 og 16 kDa var til stede i hver af prøverne, men også et meget svagt bånd på 28 kDa og et fragment på ca. 6 kDa størrelse blev observeret i nogle hjerneregioner. Endvidere blev der opnået forskelle i signalintensitet med 3F4 og 6H4 antistoffer, hvilket antyder differentiel affinitet for PrPSc, som kunne fortolkes som en anden proteinkonformation, hvor 3F4-bindende epitop var mere eksponeret end 6H4-bindende epitop. Analyse af deglycosylering afslørede tre aglycosylerede isoformer på 19, 16 og 6 kDa, som var mere intense i cortex (parietal, frontal og temporal) og svagere i occipital cortex og putamen/globus pallidus. I thalamus-regionen blev der påvist to bånd, et mere intensivt på 19 kDa og et svagere på 16 kDa. Endelig var cerebellum den eneste region, hvor et enkelt aglycosyleret bånd på 19 kDa blev observeret, svarende til det, der blev fundet i sCJD type 2. Vi kan dog ikke udelukke muligheden for, at dette fund var resultatet af tilstedeværelsen af en lille mængde PrPSc og en underrepræsentation af de andre bånd, som observeret i thalamus, hvor et bånd på 16 kDa kun blev observeret under længere eksponeringstider. Vurdering af følsomhed over for PK-fordøjelse blev opnået ved at måle absorbans af PrPSc før og efter behandling med proteinase K ved hjælp af IDEXX HerdChek BSE-testen. Denne teknologi er baseret på selektiv opfangelse af PrPSc ved hjælp af en specifik kemisk polymer gennem polyioniske interaktioner i nærvær af PrPC fra en homogenatprøve af hjernen. Absorbansværdier falder med fortynding, så det kan antages, at mængden af PrPSc er direkte proportional med absorbans. Målet med denne protokol var at udføre relativ kvantificering af PrPSc uden behandling med proteaser. Vi mener, at indførelse af et fordøjelsestrin kunne være nyttigt til nemt at evaluere den relative resistens over for PK-fordøjelse. Resultaterne viste, at absorbansværdierne faldt efter PK-behandling i alle prøverne (tabel). For multi-infarct encephalopati (MIE) og sCJD VV2 blev signaldetektionen reduceret med henholdsvis 4,32 % og 2,02 %, men reduktionerne var ikke statistisk signifikante. I modsætning hertil viste prøver fra proband og sCJD MM1 en statistisk signifikant (p < 0,005) reduktion af signalet på henholdsvis 79,82 % og 22,68 %. Absorbansværdier for MIE var under afskæringspunktet på samme niveau som negative kontroller. De resterende værdier var over afskæringspunktet. Disse differentierede niveauer af signalreduktion indikerer tre niveauer af modstand mod PK-fordøjelse: høj, mellemliggende og lav. En høj modstand mod PK-fordøjelse ville være repræsenteret ved en lav procentdel af signalreduktion, som observeret for sCJD VV2. I dette tilfælde ville reduktionen på 2 % i signalet indikere, at PK-fordøjelsen kun ville nedbryde en minimal fraktion af PrPSc, hvilket antyder en høj modstand af det abnorme prionprotein. Mellemliggende modstand ville være repræsenteret ved en lidt højere procentdel af signalreduktion, som observeret i sCJD MM1, hvor 22 % ville pege på en højere nedbrydelig fraktion af PrPSc end den observerede i det foregående tilfælde. Dette ville repræsentere en proteintype, der kun er lidt følsom over for nedbrydning med proteaser, afhængigt af hjernegruppen. Yderligere undersøgelser gennemføres for at afklare, om dette niveau af nedbrydning er forbundet med MM1-proteintype eller et fænomen, der er specifikt for dette emne. Endelig ville lav modstand mod PK-fordøjelse være repræsenteret ved en høj procentdel af signalreduktion, for eksempel de 79 %, der blev observeret i probanden, hvilket indikerer, at en høj fraktion af PrPSc er nedbrydelig. Dette antyder eksistensen af abnorme prionproteintyper, der er ekstremt modtagelige over for proteasegæring, som potentielt kan overses af detektionsmetoder baseret på den karakteristiske protease-resistens af det patologiske prionprotein.