En 11-årig, intakt, tysk hyrdehund (GSD) blev henvist til akutmodtagelsen på Institut for Kliniske Videnskaber for Selskabsdyr ved Fakultetet for Veterinærmedicin ved Utrecht Universitet med en 2-dages historie med akut opstået dyspnø og generel svaghed. Vaccination og ormekur blev udført regelmæssigt. Hunden havde besøgt Sydeuropa 6 måneder før præsentationen. Der blev ikke administreret nogen lægemidler før udviklingen af de kliniske tegn, og der blev ikke rapporteret nogen miljømæssige omstændigheder, der kunne forårsage dyspnø (f.eks. tobak, eksponering for organiske opløsningsmidler, støv). Ved fysisk undersøgelse viste hunden sig at være responsiv, men sløv med generel svaghed, svær dyspnø, cyanotiske slimhinder, forlænget kapillær genopfyldningstid, svage perifere pulser, takykardi (puls 180 slag/min) og et systolisk murmur på grad 1 ud af 6 med maksimal intensitet over højre hjertespids. Der var hårde lungelyde ved lungeauskultation. Komplet blodtælling (CBC) viste en mild, moden leukocytose (hvide blodlegemer: 18,9 × 109/L; referenceinterval 4,5–14,6 × 109/L) og et hæmatokrit på 56% (referenceinterval 42–61%). Biokemi viste ingen abnormiteter. Analyse af arteriel blodgas viste alvorlig hypoksæmi (PaO2: 48,5 mm Hg; referenceinterval 85–103 mm Hg) og mild hypokalæmi (PaCO2: 27,0 mm Hg; referenceinterval: 32–43 mm Hg). Den formodede årsag til hypokalæmien var hyperventilation. D-dimer- og antitrombin-koncentrationer var inden for referenceintervallerne. Dirofilaria immitis-antistof-snaptest (SNAP® Heartworm RT Test, IDEXX Laboratories) og fækal undersøgelse (flotation og Baermann larveisoleringsteknik) var begge negative. Thoraxrøntgen viste en dilatation af pulmonalarteriens trunkus og højre-sidede kardiomegali. Ekkokardiografi var stærkt kompliceret på grund af hundens stærke angst og gøen og var derfor begrænset. Det viste en alvorlig højre ventrikulær dilatation, mild ensartet dilatation af hovedpulsåren, systolisk fladning af interventrikulær septum og moderat tricuspid regurgitation. Anvendelsen af den modificerede Bernoulli-ligning på hastigheden af tricuspid regurgitation-strålen viste et estimeret systolisk pulmonalarterietryk på 77 mm Hg, gradet som alvorlig PH (reference < 25 mm, alvorlig > 75 mm Hg) ([]. Venstre ventrikulære dimensioner var stærkt reduceret, hvilket var i overensstemmelse med venstre-sidede volumenudtømning. En ekkokardiografi med saltvands-kontrast blev udført, som var negativ, og udelukkede dermed intra- og ekstra-kardiale højre-til-venstre shunting. For at behandle den alvorlige hypoksi og PH blev hunden placeret i en iltbur med en inspireret koncentration af ilt på mellem 40 og 50%. Endvidere blev der givet 1,5 mg/kg/8 t oral sildenafil (Viagra®, Pfizer, New York, USA) og 0,25 mg/kg/12 t oral pimobendan (Vetmedin®, Boehringer Ingelheim, Tyskland). Denne behandling påvirkede ikke hundens kliniske tilstand i signifikant grad. Dog blev arteriel hypoksi mild forbedret efter den første behandlingsdag (PaO2 steg fra 48,5 til 53 mm Hg, referenceinterval 85-103 mm Hg). Ekkokardiogrammet blev gentaget på den tredje behandlingsdag og de ekkokardiografiske ændringer og sværhedsgraden af PH blev stærkt reduceret. Den højre ventrikulære dilatation var dramatisk reduceret, interventrikulær septum var ikke længere fladet ud, og trykgradienten af tricuspid regurgitation blev reduceret fra 77 mm Hg til 41 mm Hg (reference < 25 mm Hg). Derfor blev behandlingen med pimobendan og sildenafil fortsat under den indlagte periode (7 dage). Som yderligere diagnostiske trin blev en (præ- og postkontrast) computertomografi (CT) scanning med apnø udført 4 dage efter den første præsentation efterfulgt af en kirurgisk lungebiopsi i samme anæstetiske session. En enkelt skive helisk CT scanner (Philips Secura, Philips NV, Eindhoven, Nederlandene) blev brugt. De tekniske indstillinger inkluderede 3 mm heliske skiver, 120 kV, 200 mA, 292 mm synsfelt, 512 × 512 matrix og en algoritme med høj rumlig frekvens. På CT-billederne viste lungeparenkymet subtile centrilobulære glasagtige knuder og en forstørret lungearterie. Septallinjer, pleural effusion og lymfadenopati var fraværende. CT-fund var forenelige med PH uden en endelig diagnose. Efter CT-scanningen blev en lungebiopsi fra den venstre kranielunge-lob (3 × 2 cm) taget til histopatologisk undersøgelse med en mini-thoracotomi. Umiddelbart efter denne procedure blev en behandling med dexamethason (0,25 mg/kg q24 h I.V., Rapidexon ®, Eurovet Animal Health, Bladel, Nederlandene) indledt som en sidste udvej, mens histopatologiske resultater afventedes (3 dage). Histopatologi af den kirurgiske lungebiopsi viste en moderat kronisk interstitiel histiocytisk pneumoni af ukendt ætiologi og atelektase ved hæmatoxylin og eosin, periodisk syre-Schiff og Van Giesons farvninger. Vaskulære ændringer blev oprindeligt ikke klart identificeret. På grund af den dårlige respons på den indledende behandling og den formodede dårlige prognose baseret på de histopatologiske resultater blev hunden aflivet. Autopsien blev udført med ejerens informerede samtykke. Gross patologi af lungerne viste moderat kollapsede faste lunger med et diffust, plettet udseende med flere mørke, røde foci på 1 × 1 × 3 mm og små antal hvide foci på 1 × 1 × 1 mm, ofte omgivet af en mørk rød zone (afgrænsning) tilfældigt fordelt i alle lungelapper. Rutinemæssig histopatologi af lungerne viste multifokal vaskulær ombygning. For at differentiere mellem små arterier og vener, hvilket er vigtigt for at diagnosticere PVOD, blev en yderligere farvning, der visualiserer elastiske fibre og kollagen (Weigert's resorcin Fuchsin), tilføjet for at identificere elastiske lamina. I denne hund, ligesom hos mennesker med PVOD, var alle tre kamre (arterier, vener og kapillærer) i den pulmonale mikrocirkulation påvirket, selvom ændringerne i det pulmonale venøse system var mest udtalt. Venulære læsioner inkluderede svær koncentrisk intimal proliferation, delvis til fuldstændig udslettelse af lumen og post-trombotisk rekanalisering. Kapillære læsioner var organiseret i foci, mest indlysende ved siden af omformede venuler og var karakteriseret ved proliferation af plumb endoteliale celler (svarende til PCH). Segmental overbelastning af alveolære kapillærer var også regelmæssigt forbundet med foci af PCH. ) Arterielle læsioner lignede dem af PAH med koncentrisk intimal fortykkelse ved øget ekstracellulær matrix og medial hypertrofi, men komplekse plexiforme læsioner var fraværende. ) Disse fund var i overensstemmelse med Williams et al. [] og dermed den humane ækvivalent af PVOD. Genomisk DNA fra sagen blev isoleret fra EDTA-blod ved hjælp af en semi-automatiseret Chemagen-ekstraktion robot (PerkinElmer Chemagen Technologie GmbH) og opbevaret ved -20 °C. Omkring 6 år senere blev det genomiske DNA fra sagen og et ikke-relateret sundt GSD analyseret ved hjælp af helgenom-sekventering. Integriteten af DNA blev kontrolleret på en Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, USA) og kvantificeret ved hjælp af Qubit dsDNA HS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA). DNA-biblioteker blev fremstillet ved hjælp af TruSeq Nano library prep kit (TruSeq Nano library prep kit, Illumina, San Diego CA, USA) ved hjælp af 200 ng gDNA input. Helgenom-sekventeringsinformation ved 30x dækning blev opnået ved hjælp af et HiSeqX Ten instrument (HiSeqX Ten instrument, Illumina, San Diego CA, USA) og 2 × 150 basepar parrede ende-læsninger. Data blev behandlet med vores internt udviklede pipeline v1.2.1 () herunder somatiske mutationsanalyse (Strelka, VarScan, FreeBayes og MuTect) og et genomanalyseværktøj (GATK v. 3.2.2) [] i overensstemmelse med retningslinjerne for bedste praksis []. Sekvenslæsninger blev kortlagt mod Canine Reference Genome (CanFam 3.1) ved hjælp af Burrows-Wheeler-justering med maksimale nøjagtige match (BWA-MEM) v0.7.5a [] efterfulgt af markerede duplikater, sammenlægning af baner og realignment af indels. Basiskalibrering blev ikke udført. I humanmedicin er mutationer i BMPR2, ACVRL1, ENG, KCNK3, CAV-1 og SMAD9 blevet foreslået at være årsag til en autosomal dominant form af PAH []. Disse gener blev inkluderet i analyser for at forhindre manglende kandidatmutationer på grund af fænotypiske fejlklassifikationer. Sammenligning af tilfælde og kontrol afslørede 196 unikke introniske varianter ved analyse af disse gener. Sammenligning af sekvensen af EIF2AK4 i tilfældet og den sunde GSD afslørede 124 unikke varianter, hvoraf 9 var placeret i 3'UTR, 112 var introniske og 3 var eksoniske varianter. Tilfældet var homozygot mutant for c.2961T>C og c.1266G>A, en heterozygot variation blev fundet ved c.2092G>A. Variantvalidering blev udført ved Sanger-sekventering på amplificerede polymerasekædereaktions-produkter fra genomisk DNA ved hjælp af Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). Efter exonuclease I-behandling blev DNA-sekvensreaktioner udført ved hjælp af BigDye v3.1 og sekventeret på en ABI3130XL og analyseret i Lasergene (version 12.0 DNASTAR). Fire af de fem yderligere GSD'er, ukendt for enhver form for respiratorisk stress og i alderen ≥ 10 år, afslørede den samme genotype som tilfældet og blev derfor udelukket som årsagsvarianter for PVOD.