En 4-årig eurasisk odder født i 2015 i 'Sendaviva, Natural Park of Navarra' (42°11′31″N, 1°09′54”O) (Nordøst Spanien) blev overført til 'Terra Natura' vildmarkspark (Sydøst Spanien) i 2017. 'Terra Natura' vildmarkspark ligger i de periurbane omgivelser i Murcia by (38°00′40″N, 1°09′54”O). Odderburet bestod af et område med frit tilgængelige skjulesteder og en dam med 4 dyr af denne art (2 hanner og 2 hunner). Der blev ikke anvendt anti-sandfluesmiddel på odderne. I august 2019 viste dyret bilateral epistaxis, anoreksi, apati og vægttab. Dyret blev bedøvet før håndtering med medetomidin (0,2 mg/kg/i.m.) og ketamin (20 mg/kg/i.m.). Hele blodet blev taget ved venepunktur i den cephaliske vene, drænet i et 1 ml rør overtrukket med ethylendiamintetraacetat (EDTA) og et 1 ml rør uden antikoagulant til en komplet blodtælling (CBC) og biokemiske analyser. CBC blev udført i en blodtæller (ADVIA 120 Hematology System, Siemens, Italien), og de biokemiske analyser blev udført i en automatiseret biokemisk analysator (Olympus AU600 Automatic Chemistry Analyzer, Olympus Europe GmbH, Hamburg, Tyskland). Desuden blev urin taget ved ultralydstyret cystocentesis til urinalyse. En ultralydundersøgelse af hjertet og maveorganerne, herunder nyre, milt, lever, galdeblære, bugspytkirtel og fordøjelsessystemet, blev udført. Da de biokemiske og ultralydsresultater var forenelige med den kliniske leishmaniose, blev der udført serologiske og molekylære tests for at bekræfte infektionens tilstedeværelse. Tilstedeværelsen af anti-Leishmania IgG2 antistoffer blev evalueret i otterens serum ved hjælp af en tidsafhængig immunofluorometrisk analyse (TR-IFMA), som blev udført som beskrevet af Cantos-Barreda et al. []. For at teste, at TR-IFMA-analysen, som er valideret til brug i hunderserum, kunne anvendes til otters serum, blev der udført en Western blot analyse. Western blot blev udført i sera fra otter med leishmaniose-kompatible tegn og fra en Leishmania-seropositive hund ved TR-IFMA. Sera (1:2000 fortynding) blev separeret under reducerende betingelser på mini polyacrylamidgeler (0,1 % natriumdodecylsulfat (SDS), 12 % opløsende gel og 4 % stageregel). De opløste proteiner blev overført til en nitrocelluloseplade (Bio-Rad, USA) og placeret i et ROTI®Lumin substrat (Carl Roth, Tyskland) for at blokere i 2 timer ved stuetemperatur. Fårepolyklonale antistoffer anti-hund IgG2 (AHP498; Bio-Rad, USA) ved 1:1000 fortynding blev brugt som det primære antistof, mens kanin anti-fårehornets IgG peroxidase (HRP)-konjugeret (SAB3700702; Sigma-Aldrich, USA) ved 1:1000 fortynding blev brugt som det sekundære antistof til at detektere det primære antistofs binding. Signaldetektionen blev udført ved hjælp af et Pierce ECL2 kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, USA) og blev digitaliseret i en Typhoon 9410 scanner (GE Healthcare, USA). Et bånd på ca. 150 kDa blev observeret i otterprøven samt i hundprøven (se figur og yderligere fil). Disse fund bekræftede, at TR-IFMA-analysen, som bruger fårepolyklonale anti-hund IgG2, var i stand til at detektere otters IgG2. TR-IFMA-analysen bestod af en ikke-kompetitiv indirekte metode baseret på biotinyleret K39 rekombinant antigen som et opfangende reagens og anti-hund IgG2 polyklonalt antistof (Får anti-hund IgG2, Bio-Rad, USA) Eu3 +-mærket som en detektor. Testen inkluderede serum fra en syg Leishmania-seropositive hund som en positiv kontrol og serum fra en sund Leishmania-seronegative hund som en negativ kontrol. Analysen blev udført i en multi-label tæller (VICTOR2 1420, PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Turku, Finland). Resultaterne blev udtrykt som enheder af fluorometri for Leishmania (UFL). Cut-off blev sat til 22 UFL. Der blev også udført en enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) (Leiscan® Leishmania ELISA Test, Esteve Veterinaria, Laboratorios Dr. Esteve SA, Barcelona, Spanien) til påvisning af specifikke IgG antistoffer mod Leishmania spp. i henhold til producentens anvisninger. Seraprøverne blev fortyndet 1:20, og resultaterne blev udtrykt som S/P-forhold (S/P = serum/positive), beregnet ved optisk densitet (OD) serum/OD lav positiv kontrol. S/P-forhold over 1,1 blev betragtet som positiv. Leishmania spp. DNA i fuldblod og knoglemarv blev evalueret ved amplifikation af kinetoplast DNA-sekvensen af Leishmania spp. ved hjælp af en rtPCR med primere og prober, der tidligere er beskrevet []. Knoglemarv blev taget ved hjælp af en fin-nål aspiration fra den costochondrale union og drænet i et 1 ml rør belagt med EDTA. DNA blev ekstraheret ved hjælp af High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, Tyskland) efter producentens anvisninger. rtPCR blev udført i QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Den interne kontrol TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents (VIC Probe) (Exo IPC) (Applied Biosystems, CA, USA) blev inkluderet. rtPCR blev udført i et endeligt volumen på 20 μL, herunder 1× iTaq Universal Probes Supermix (Bio-Rad, CA, USA), 900 nM af hver primer, 200 nM af TaqMan probe, 1× Exo IPC Mix, 1× Exo IPC DNA og 50 ng DNA fra hver prøve. Cyklingsparametrene var: 50 °C i 30 s, 95 °C i 10 min, 45 cykler ved 94 °C i 30 s og 55 °C i 1 min. Hver amplificeringsrunde inkluderede positive og negative kontroller, og hver måling blev udført i tre eksemplarer. For identifikation af Leishmania-arter blev PCR-produkterne fra de positive prøver renset ved hjælp af High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, Tyskland) og forelagt til sekventering i afdelingen for molekylærbiologi, University of Murcia. De opnåede sekvenser blev sammenlignet med dem, der er tilgængelige i GenBank. Som negativ kontrol blev de samme analyser desuden udført på en 3-årig kvindelig eurasisk odder fra den samme dyrepark uden kliniske tegn, der var forenelige med leishmaniose. Alle resultater vises i tabel. Forekomsten af leishmaniose blev bekræftet, og specifik behandling blev administreret (allopurinol 15 mg/kg/24 t/p.o.). Behandlingsovervågning blev udført i november 2019 efter 3 måneders behandling. Der blev observeret bilateral nefropati med hydronephrose, mesenterisk lymfadenomegali og ascites. CBC afslørede fald i hvide blodlegemer og fald i blodplader hos den leishmania-positive odder. Serum-biokemisk profil for den leishmania-positive odder viste hyperproteinæmi, hyperglobulinæmi, fald i PON-1 og stigninger i haptoglobin og ferritin. Urinalysen afslørede proteinuri og fald i osmolaritet og specifik tyngdekraft. Tilstedeværelsen af anti-Leishmania IgG2 antistoffer og et positivt resultat ved RT-PCR i form af helblod og knoglemarv blev observeret for den leishmania-positive odder. Sekventering af positive prøver bekræftede identifikationen af L. infantum. Den amplificerede sekvens udviste 100 % lighed med en L. infantum referencesekvens. Derudover blev der observeret ovale mikroorganismer med en excentrisk kerne, der var kompatibel med Leishmania spp. amastigoter, i cytologien af milten (Fig.