En 52-årig kvinde med en historie om cholecystektomi og delvis resektion af den venstre leverlappe i 2004 på grund af symptomatisk galdesten og flere intrahepatiske galdegangslidelser havde intermitterende feber og progressiv gulsot fra begyndelsen af november 2014. En galdegangsobstruktion og en mistanke om en malign sygdom i den leverbærende del af milten blev opdaget ved efterfølgende ultralyd, MR-cholangiopancreatografi (MRCP), MR-scanning og en positronemissionstomografi-computertomografi (PET-CT). En eksplorativ laparotomi blev udført i slutningen af november 2014 (Yderligere fil: Figur S1) og viste en alvorlig intraabdominal adhæsion, en klump (1 × 2 cm) med hærdet struktur i den venstre leverlappe og dissemineret neoplastisk læsioner, der infiltrerede milten, den fælles lever-mave-gang, lever-mave-gang-båndet, de omkringliggende lymfeknuder, leverarterien, portalvenen og den celia-akse. Disse fund tvang kirurgerne til at opgive radikal resektion. Purulent galde blev udledt fra den fælles galdegang, og en slimprop stak ud fra væggen i galdegangene. Delvise neoplastiske læsioner blev fjernet fra de forstørrede lymfeknuder, nubben i den venstre leverlappe og kanten af den fælles leverarterie til patologisk undersøgelse. En galdevejstømning blev installeret for at afhjælpe galdegangsobstruktionen. Patologiske rapporter afslørede, at arten af tumoren var et dårligt differentieret adenocarcinom med differentieringsmarkører af cholangiocyt; desuden blev en moderat EGFR-ekspression påvist i >90% af tumorcellerne. Denne patient blev endelig diagnosticeret som fremskreden, ikke-operabel, perihilar CCA. Fem uger efter palliativ kirurgi modtog patienten et 4-ugers forløb af TOMO-terapi på den fælles galde-mavesygdom (DT = 60 Gy/25 F), en cyklus med systematisk kemoterapi med albuminbundet paclitaxel alene på grund af hendes intolerable gastrointestinale toksiciteter og infusion af autologe cytokine-inducerede dræberceller. På grund af den progressive stigning af CA199 blev PET-CT straks efter afsluttet radioterapi re-undersøgt og viste en ny, hypermetabolisk, metastatisk læsion i den leverbærende del af caudatus lobe og forstørrede blødt væv og retroperitoneale lymfeknuder med abnorm standardiseret optagelse (SUV) mellem leveren og maven sammenlignet med PET-CT før radioterapi. Fire uger efter radioterapi blev patienten indskrevet i CART-EGFR-forsøget. Hendes performance status var 1 i henhold til kriterierne fra Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG). Under forberedelsen af CART-EGFR-celler udviklede hun høj feber, aggressiv gulsot og obstruktion af galdegangene, ledsaget af den fortsatte stigning af CA199 (fra 100,5 til 413,5 U/ml), aggressiv stigning af total bilirubin, direkte bilirubin og andre galdegang-relaterede enzymologiske indekser og blev behandlet med effektive bredspektrede antibiotika og endoskopisk placering af galdegangsstent i leverens galdegang. Forsøgene (ClinicalTrials.gov-identifikator NCT01869166, NCT02541370) blev godkendt af Institutional Review Board på det kinesiske PLA General Hospital. Ingen kommerciel sponsor var involveret i studierne. De indrullerede patienter gav skriftligt informeret samtykke i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen. DNA-sekvensen af enkeltkæde-fragment-variabel (scFv) målrettet mod EGFR antigen blev afledt fra JQ306330.1 (GenBank nummer). Anti-EGFR scFv-CD137-CD3zeta CAR blev genereret og klonet i pWPT lentiviral backbone, beskrevet i detaljer af Feng et al. []. Konstruktionen blev verificeret ved DNA-sekventering. En pseudotypificeret, klinisk-grad lentiviral vektor supernatant blev produceret ved standard transient transfektion som beskrevet af McGinley et al. []. Ifølge producentens instruktioner af Lipofectamine 3000 transfektion reagent (Invitrogen, USA), blev pWPT-anti-EGFR CAR plasmid, ps-PAX2 emballage plasmid og pMD2.G plasmid til konvolutterne transfekteret i 293 T celler. De lentivirale supernatanter blev indsamlet og opbevaret ved -80 °C. GFP-CD137-CD3zeta vektor blev konstrueret for at verificere transduktions effektiviteten ved hjælp af FACSCalibur flow cytometri (BD Biosciences). DNA-sekvensen af scFv målrettet mod CD133 antigen blev afledt fra HW350341.1 (GenBank nummer), generationen, konstruktionen og testningen af CAR133 T celler fulgte samme procedure som CART-EGFR celler (Yderligere fil: Figur S2). CART-celler blev fremstillet fra autologe perifere mononukleære celler (PBMC'er) indsamlet i cellepræparationsrør (BD Biosciences, San Jose, CA) renset fra 80 til 100 ml helblod på den kinesiske PLA General Hospital Good Manufacturing Practice Facility i henhold til de nuværende standardprocedurer. PBMC'er blev stimuleret med 50 ng/ml anti-CD3 MoAb (Takara, Japan) og 500 U/ml rekombinant humant interleukin-2 (Peprotech, USA) i GT-T551 medium (Takara). Lentiviral transduktion blev udført i GT-T551 medium med protaminsulfat (Sigma) i 24 timer efter 2 dages T-cellekultur. Derefter blev cellerne yderligere udvidet i dyrkningssække (Takara) og høstet som CART-celler. Bakterier, svampe og endotoksin blev testet før infusion af CART-celler. CART-cellernes immunophenotype blev analyseret ved flowcytometri med fluorescerende mærkede antistoffer, der er specifikke for farvning af CD3, CD4, CD8, CD45RO, CD62L og CCR7. Isotype-matchede monoklonale antistoffer (BD Biosciences) blev brugt til kontrolfarvning. CAR-ekspression blev estimeret baseret på GFP-CD137-CD3zeta-transducerede celler i samme batch for alle patienter ved flowcytometri. Dataindsamling og analyse blev udført ved hjælp af en FACSCalibur flowcytometri (BD Biosciences). In vitro cytotoksicitet af CART-EGFR-celler blev testet ved co-kultur med EGFR-positive tumorceller ved forskellige effektor-til-mål-forhold i 96-brønds plader ved hjælp af et 4-t CCK-8 Detection kit (DOJINDO, Japan). Kvantificeret real-time PCR (Q-PCR) blev anvendt til at vurdere niveauet af CAR fusionsgen i henhold til en tidligere beskrevet protokol.13 Et 153-bp (basepar) fragment, der indeholder dele af CD8a-kæden og den tilstødende 4-1BB-kæde (den forreste primer 5′-GGTCCTTCTCCTGTCACTGGTT-3′ og den bagerste primer 5′-TCTTCTTCTTCTGGAAATCGGCAG-3′) blev amplificeret af ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). Beta-actin blev anvendt som en intern kontrol. En 7-punkts standardkurve, der bestod af 100 til 108 kopier/μl plasmid DNA, der indeholdt CAR-genet, blev fremstillet. Serum IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-12/IL23p40, IFN-γ, TNF-α, VEGF og Granzyme B blev testet ved hjælp af en BD Biosciences mikrobead sandwich immunoassay i overensstemmelse med producentens anvisninger. Ifølge dyrkningssystemet som rapporteret tidligere [], blev CART-EGFR-celler genereret fra de mononukleære celler fra 80-100 ml af patientens perifere blod og frigivet til infusionerne. Af de infuserede celler under den første cyklus af CART-EGFR-terapi var 99,14 % CD3+-celler, hovedsageligt sammensat af CD8+-undergruppen (62,26 %), og 23,61 % blev karakteriseret med den centrale hukommelsesfænotype (CD45RO+/CD62L+/CCR7+). Derudover var 8,99 % af de infuserede celler EGFR-positive. Fænotypen og transfektions-effektiviteten af infuserede CART-EGFR-celler i hver cyklus er dokumenteret i tabel. CART133 celler blev genereret og dyrket i henhold til samme procedure som CART-EGFR celler. Af de infuserede celler var 95,2 % CD3+ celler, hovedsageligt sammensat af CD8+ undergruppen (71,9 %), og 41,9 % var CD45RO+/CD62L+/CCR7+ undergruppen. Desuden var 6,4 % af de infuserede celler CD133 positive. Detaljer er dokumenteret i tabel. På grund af den nyligt afsluttede strålebehandling inden for 2 måneder og intolerance over for kemoterapeutiske midler, blev patienten administreret med 4-dages successive infusioner af 2,2 × 106/kg CART-EGFR-celler i alt uden nogen konditioneringsterapi, og opnåede en PR i sin første vurdering 6 uger senere, evalueret i henhold til Response Evaluation Criteria in Solid Tumors version 1.1 (RECIST 1.1) med både MRI og PET-CT, som illustrerede en mere end 80% krympning af metastatiske læsioner i den hepatiske hilar region og caudate lobe og en bemærkelsesværdig nedgang af SUV, sammen med en hurtig nedgang af CA199 fra 413,5 til 123,1 U/ml. CAR transgene kopitallet i patientens perifere blod nåede et højdepunkt på 5916 pg/dl på dag 9 ledsaget med frigivelse af cytokiner såsom interleukin-6 (IL-6) og C reaktivt protein (CRP). Den anden cyklus af CART-EGFR monoterapi blev administreret med en dosis af EGFR-CAR+ udtrykkende T celler 2,1 × 106/kg og uden nogen præ-konditionering behandling, fordi CAR transgene kopitallet i perifert blod faldt tæt på baseline niveau 2 måneder efter den første infusion af CAR-EGFR udtrykkende genetisk modificerede T celler. Rutinemæssige undersøgelser af MRI og PET-CT viste en vedvarende PR ledsaget med en yderligere reduktion af CA199 til 61,2 U/ml. Interessant nok nåede toppen af CAR transgene kopitallet efter den anden cyklus infusion af CART-EGFR celler ikke et parallelt eller højere niveau som den første cyklus af CART-EGFR terapi gjorde. PR status af patienten blev opretholdt i 8,5 måneder indtil hun udviklede hyppig uhåndterlig opkastning, øvre abdominal kedelig smerte og gastrisk syre reflux, som opstod i midten af november 2015. Den efterfølgende elektroniske gastroskopi viste striktur af duodenal bulb, og PET-CT bekræftede tumor progression med illustration af flere nye SUV abnormale læsioner i omentum majus, peritoneum og abdominal hulrum. Herefter blev patienten behandlet med 1 cyklus af CART-EGFR-terapi kombineret med 2 cyklusser af anti-programmeret celledødsprotein 1 (PD-1) monoklonalt antistof (Nivolumab, Bristol-Myers Squibb), som blev administreret i en dosis på 100 mg hver 2. uge. Ligeledes nåede CAR-transgen-kopitallet, som blev overvåget i perifert blod, ikke et lignende topniveau som ved infusionen i den første cyklus, selv når det blev kombineret med anti-PD-1-antistof. På trods af at serum CA199 faldt midlertidigt fra 326,3 til 210,8 U/ml, opdagede den efterfølgende PET-CT nyligt opståede metastaser i bunden af bækkenet, højre leverlob og venstre supraclavikulær lymfeknude samt udvidelse af tidligere tumorlæsioner i maven sammenlignet med PET-CT før den kombinerede immunterapi. Da mere end 90 % af tumorcellerne udtrykte CD133-protein (Supplerende fil: Figur S3), blev patienten derefter indskrevet i CART133-forsøget og modtog infusionen af 1,22 × 106/kg CD133-specifikke CART-celler uden konditionerende behandling. På grund af forekomsten af obstruktion i den nedadgående duodenum og den deraf følgende vedvarende svære infektion i galdegangene samt leverabscess, som kan påvirke niveauet af serum CA199 og blev behandlet med antibiotika, blev den planlagte billeddiagnostiske evaluering udsat indtil 2 måneder efter infusionen af CART133-celler, hvor kontrastforstærket CT viste bemærkelsesværdig krympning eller endda forsvinden af nogle metastaser i peritoneum og abdominalhulen, hvilket førte til en evaluering af PR. CAR-transgenkopien i perifert blod (PB) svingede fra 377 til 919 pg/dl. Patienten følte vedvarende kedelig smerte i hendes øvre mave 2,5 måneder senere, og den efterfølgende CT-scanning opdagede en ny metastatisk læsion på ca. 40 × 70 mm under abdominalvæggen og mistænkte metastaser i abdominalhulen ledsaget af CAR-transgenkopien i PB, der faldt tæt på baseline-niveauet, hvilket førte til en konklusion om progressiv sygdom (PD). Uønskede hændelser såsom kulderystelser, feber, træthed, opkastning og muskelsmerter, der opstod under infusionen af CART-EGFR-celler, var normalt milde, tålelige og kunne håndteres med understøttende behandling. Patienten udviklede dog et lavere feber uden kulderystelser, hoste, diarré eller andre infektiøse symptomer, der varede i 9 dage fra den tredje dag efter infusionen af CART-cellerne. Gentagne laboratorieundersøgelser af PB viste normalt antal hvide blodlegemer, neutrofilforhold, negativ procalcitonin (PCT) og blodkulturer, som ikke understøttede diagnosen infektion, men i mellemtiden eskalering af IL-6 og CRP og akut stigning af glutamic-pyruvic transaminase og glutamic-oxalacetic transaminase (>6ULN). Der var et par spredte små udslæt, der optrådte i venstre lår 2 uger efter den første cyklus infusion af CART-EGFR-celler, som gradvist blev værre og blev synlige og kløende med præsentationen af flere skællede eller lineære udslæt, der spredte sig fra venstre lår til læggen og fusionerede sammen, som blev klassificeret 2 i henhold til den fælles terminologikriterier for uønskede hændelser 4.0 (CTCAE 4.0), da den anden cyklus af CART-immunterapi blev opfyldt. Udslættene blev biopsi med illustration af lichen striatus-lignende patologiske ændringer såsom tab af delvis epidermis, vakuolær degeneration af basalceller og infiltration af adskillige T-lymfocytter i epidermis og dens vedhæng, og blev håndteret med succes med tacrolimus salve. Der opstod ingen hypotension under hele CART-EGFR-behandlingen. Bortset fra mild kvalme, opkastning, kulderystelser, feber og træthed, var der ingen andre akutte bivirkninger i forbindelse med kombinationsbehandlingen. Skæl optrådte og forværredes efter den kombinerede immunterapi, men krævede ikke medicinsk indgriben. Serumniveauer af cytokiner såsom tumornekrosefaktor-α (TNF-α), IL-6 og CRP steg lidt og fremkaldte ingen symptomer på cytokinfrigivelse. Under infusionen af successive dosis-eskalerende CART133 celler over 4 dage, var der ingen andre bivirkninger bortset fra infusionsrelateret mild feber og træthed. Men den anden morgen efter afslutningen af CART133 celle infusionen, udviklede denne patient periodisk øvre abdominal smerte, kulderystelser, feber (39,1 °C), sporadiske små blødninger og kongestiv udslæt på hendes læg, som hurtigt og diffusivt spredte sig til hendes hals, højre overarm, bryst, venstre underliv og retropharyngeale slimhinder ledsaget af kløe og diarré om eftermiddagen og forværredes yderligere i de følgende 10 dage og programmeret celledødsproteinligand 1 (PD-L1) [,], hvilket resulterer i et hurtigt tab af deres cytolytiske og cytokinsekretionskapacitet og en tilstand af hyporesponsivitet []. Endvidere udviser solide tumorer ofte metaboliske afvigelser ved overforbrug af vigtige aminosyrer, som er kritiske for T-celleaktivitet, og inducerer hypoksi og en deraf følgende surhed af ekstracellulær matrix på grund af utilstrækkelig vaskulær forsyning, som er fjendtlig over for T-celleoverlevelse []. Derfor er det nødvendigt at modulere tumormikromiljøet for at forbedre resultaterne. I dette tilfælde, på trods af at patienten ikke modtog nogen direkte konditionerende behandling med det formål at transformere tumormikromiljøet, blev hun behandlet med 60 Gy strålebehandling før immunterapi med et interval på ca. 1 måned fra slutningen af strålebehandlingen til begyndelsen af CART-celleinfusionen. Selv om strålebehandlingen i sig selv ikke effektivt udryddede tumorceller, kan dens direkte og forsinkede virkning spille en rolle i ødelæggelsen af det tumorstøttende stroma, ændre biologien af tumormikromiljøet, fremme frigivelsen af flere tumorassocierede antigener og forbedre immungenkendelsen []. Endvidere kunne strålebehandlingen gøre tumorer mere immunogene og mere modtagelige for et forbedret angreb fra immuncellerne [], og den kunne endda generere antitumorvirkninger i de fjerne metastaser, som ikke var lokalt bestrålet (kaldet den abskopale virkning) [, ]. Vi fremsætter derfor en hypotese om, at strålebehandling kunne være en rimelig og effektiv konditionerende behandling til forbedring af resultatet af CART-terapi. Da modstanden mod CART-EGFR-terapi blev bekræftet, prøvede vi en gang en kombination af immunterapi med anti-PD-1-antistof i forbindelse med infusion af CART-EGFR-celler på grundlag af en præklinisk undersøgelse, der viste, at blokering af PD-1-immunsuppression kunne øge den terapeutiske virkning af CART-cellebehandling mod etablerede solide tumorer væsentligt []. Desværre endte behandlingen med et nederlag, hvor PET-CT bekræftede sygdommens progression, selv om CA199 var midlertidigt nedsat. En mulig forklaring er det uklare niveau af PD-L1-ekspression. For nylig er PD-L1-ekspression fremhævet for dens værdi i at forudsige den terapeutiske virkning af anti-PD-1-lægemidler. Tumorlæsionen var imidlertid vanskelig at biopsere på grund af dens anatomiske placering, hvilket medførte, at niveauet af PD-L1-proteinekspression på tumorceller ikke kunne påvises nøjagtigt før indledningen af anti-PD-1-terapi, hvilket er en mulighed for, at PD-L1-ekspression i tumormilieu kan være på et lavt niveau eller endda negativ og derfor føre til, at anti-PD-1-behandlingen mislykkes. I mellemtiden var der mange andre parallelle checkpoint-veje, der potentielt kunne understøtte resistens over for anti-PD-1-terapi [] Under denne situation var det afgørende at vælge et rationelt mål for næste trin i patienternes behandling. For nylig har CSC'er i CCA tiltrukket stor opmærksomhed på grund af deres stærkt kræftfremkaldende egenskaber og centrale roller i at formidle selvfornyelse, tumorgenvækst og terapeutisk resistens, og derfor er terapi, der er målrettet mod overflademolekylmarkører og signalveje, der er specifikke for CSC, en mulig potent mulighed for CCA [,]]. Blandt de molekyler, der anvendes individuelt eller i kombination til at identificere cholangiocarcinomstamceller, er CD133 en af de vigtigste stamcellemarkører, der er forbundet med højere invasivitet og dårligere prognose [] Shien og kolleger rapporterede også, at CD133-positive tumorceller viste større resistens over for postoperativ behandling end CD133 negative celler, og øget CD133-ekspression blev observeret i resterende kræftceller efter adjuverende behandling [] På grundlag af ovenstående valgte vi endelig CD133 som det målantigen for CART-immunterapi, som igen producerede et andet delvist respons og viste, at CART-cocktail-immunterapi kan være gennemførlig og rationel. Et andet vigtigt problem var toksiciteten, som kunne fremkaldes af CART-EGFR-cellerne på de målrettede antigener, der udtrykkes på tumorceller og/eller samtidigt på normale celler, hvilket kaldes en "on-target off-tumor"-effekt. Skader på normale celler kan endda opstå som følge af uventede krydsreaktioner med et protein, der ikke udtrykkes på tumorceller []. Siden infusionen af CART-EGFR-cellerne startede, oplevede patienten ikke kun feber, kulderystelser og træthed, men også vedvarende pyrexi, akut stigning i serumtransaminaser og forsinket udslæt, som blev ledsaget af en kraftig stigning i antallet af CAR-transgene kopier, IL-6 og CRP, selv om niveauerne ikke opfyldte kriterierne for diagnosticering af cytokinfrigivelsessyndrom [, ]. De massive cytokiner, som kunne fremkaldes direkte af de infuserede CART-celler, afspejlede en kraftig immunrespons, som kunne generere både antitumorvirkninger på tumorceller og bivirkninger på normale celler. Desuden var on-target off-tumor-effekten forårsaget af CART-EGFR-cellerne sandsynligvis årsagen til udløsningen af dermatologiske, orale slimhinde- og gastrointestinale bivirkninger som f.eks. kongestiv udslæt og blødning. Alle disse bivirkninger var dog milde, reversible og blev håndteret med understøttende behandling og topikal kortikosteroid. Tilføjelsen af anti-PD-1-antistof forværrede tilsyneladende ikke toksiciteterne ved CART-EGFR-immunterapi i dette tilfælde. Ikke desto mindre forværredes denne patients dermatologiske, orale slimhinde- og gastrointestinale bivirkninger som f.eks. kongestivt udslæt og blødning alvorligt ved efterfølgende behandling med infusion af CART133-celler. Selv om disse toksiciteter blev håndteret med succes ved emergente medicinske indgreb, herunder intravenøs methylprednisolon og anti-TNF-inhibitor, kan den iboende mekanisme i høj grad skyldes on-target off-tumor-effekten af CART133-celler, som er målrettet mod CD133-antigenet, der udtrykkes på normalt epithelium og vaskulært endotel. Det er dog uklart, om anti-PD-1-antistof og resterende CART-EGFR-celler in vivo kunne spille en rolle i forværringen af toksiciteterne ved CART133-immunterapi.