Det drejede sig om en 22-årig mand med B-ALL, som havde haft en tredje knoglemarvstransplantation (BM) før indskrivning i vores kliniske protokol med brug af TanCAR-T 19-celler. Han blev diagnosticeret med B-ALL med mere end 100 × 109/l WBC-tal og normal karyotype i januar 2016. Efter fuldstændig remission (CR) 2 gennemgik han haplo-HSCT fra sin far 10 måneder efter den oprindelige diagnose. Han havde lidt hemoragisk cystitis og akut GVHD i 2. grad inden for 2 måneder efter haplo-HSCT, som forsvandt med 15 daglige doser methylprednisolon 50 mg efterfulgt af 5 daglige doser methylprednisolon 100 mg. Tre måneder efter seponering af cyclosporin A og methylprednisolon, oplevede han recidiv med 6,4% marv-blastyper, mens han stadig havde fuld donor-kimærisme, og han udviklede hurtigt GVHD i 2. grad med 56,5% marv-blastyper ved flowcytometri 10,6 måneder efter haplo-HSCT, og der blev dokumenteret ingen donor-kimærisme på samme tid. Han modtog salvage-kemoterapi med MOEP (3 daglige doser af mitoxantron 10 mg, vindesine 4 mg, 3 daglige doser af etoposid 100 mg og 5 daglige doser af dexamethason 15 mg), og han havde svær knoglemarvsdepression og intet respons med 65,4% marv-blastyper 1 måned efter den første cyklus af MOEP. Derefter blev han behandlet med vores haplo-CAR-T 19-celleprotokol. Han modtog cytoreduktionskemoterapi med vindesine og methylprednisolon plus hydroxyurea og lymphodepletering med daunorubicin og cyclophosphamid, og hans marv-blastyper faldt til 12,7% før haplo-CAR-T 19-celleinfusion. Haplo-CAR-T 19-celler i en dosis på 4,91 × 106/kg (2,89 × 107 T-celler/kg, 17% transfektions-effektivitet) blev administreret og inducerede MRD-negativ CR (MRD-CR) og fuld donor-kimærisme inden for 2 uger efter infusion. De infuserede haplo-CAR-T 19-celler udviste hurtig ekspansion og toppede med 15.281 kopier pr. mikrogram DNA inden for de første 2 dage efter infusion, men faldt fra 3374 kopier pr. mikrogram DNA på dag 7 til 468 kopier pr. mikrogram DNA på dag 12; methylprednisolon 160 mg og dexamethason 5 mg blev brugt på dag 11 til behandling af grad 3 cytokine-frigivelsessyndrom (CRS). Han oplevede grad 3 akut GVHD inden for 1 måned efter haplo-CAR-T 19-celleinfusion, som var under kontrol med 5 daglige doser af methylprednisolon 40 mg plus cyclosporin A 80 mg administreret fra dag 31 efter haplo-CAR-T 19-celleinfusion. Imidlertid oplevede han 1 måned efter opnåelse af MRD-CR, at hans sygdom udviste florid progression med WBC-tal stigende fra 1,59 × 109 til 12,52 × 109/l og tilsvarende procent af cirkulerende blastyper stigende fra 1,39 til 67,37% inden for 2 uger; hans knoglemarv udviste stærkt aktiv cellulær proliferation med 59,67% blastyper, som havde CD19+ CD34+ CD10+ CD22+ CD38+ CD58+ CD33+ CD20− CD13− CD15−. Samtidig blev der dokumenteret ingen haplo-CAR-T 19-celler og donor-kimærisme. I dette tilfælde kunne andre behandlinger, herunder TanCAR-T 19/22-celler, snarere end rednings-kemoterapi eller reinfusion af CAR-T 19-celler, være en potentiel behandlingsmulighed for denne patient på grund af det dårlige respons på rednings-kemoterapi og den dårlige persistens af infusion af CAR-T 19-celler. En højere tumorbelastning og kort tidsinterval efter seponering af steroider øgede dog risikoen for fejl i generationen af autologe CAR-T-celler; florid progression af sygdommen gjorde, at det var mindre muligt at vente, indtil steroiderne var aftaget. Donor-afledt TanCAR-T 19/22-cellebehandling var en optimal tilgang til at overvinde dette problem, men som det er velkendt, bør haplo-CAR-T-cellebehandlinger ikke rutinemæssigt anbefales i forbindelse med tidligere GVHD, der kræver steroider, hovedsageligt på grund af den øgede bekymring for den høje risiko for GVHD-reaktivering. Efter mere omhyggelig overvejelse af de kliniske fordele og risici ved den anden haplo-CAR-T-celleinfusion blev han indskrevet i vores medfølelsesmæssige kliniske protokol ved hjælp af haplo-TanCAR-T 19/22-celler. Hans far gennemgik aferese, og de perifere blodmononukleære celler (PBMC'er) blev brugt til at forberede TanCAR-T 19/22-cellerne. Han modtog cytoreduktionskemoterapi med vindesine 4 mg og fem daglige doser methylprednisolon 80 mg og tre daglige doser hydroxyurea 3 g efterfulgt af en lymphodelpeting-kemoterapi med idarubicin i en samlet dosis på 30 mg og cyclophosphamid i en samlet dosis på 3 g. Planlagt knoglemarvsaftrensning efter den ovennævnte kemoterapi og før haplo-TanCAR-T 19/22-celleinfusion blev ikke udført på grund af dårlig compliance hos patienten. To dage senere blev han behandlet med haplo-TanCAR-T 19/22-celler i en samlet dosis på 4,72 × 106 TanCAR-T 19/22-celler pr. kg (3,05 × 107 T-celler pr. kg, 15 % transfektions effektivitet) administreret via fraktioneret dosering (D0, 30 %; D1, 70 %) af hensyn til sikkerhed. De materialer og metoder, der blev brugt i produktionen af TanCAR-T 19/22, er blevet beskrevet tidligere [–], med undtagelse af konstruktionen af CAR og kilden til PBMC'er, der blev brugt til fremstilling af TanCAR-T 19/22-cellerne. TanCAR-19/22 var et tandem CAR-molekyle, der bestod af en anti-CD22 scFv afledt fra mus m971 mAb [] og anti-CD19 scFv afledt fra mus FMC63 mAb [], der var samlet i tandem, human CD8α-hængsel og transmembrandomæne og human CD137- og CD3ζ-signaleringsdomæner. En skematisk af TanCAR-19/22 er vist i figur a. PBMC'er, der blev brugt til fremstilling af TanCAR-T 19/22-cellerne, blev indsamlet ved leukaferese frem for frisk perifert blod (PB). Flowcytometri blev brugt til at bestemme TanCAR-19/22 transfektions effektivitet og kvantificering af haplo-TanCAR-T 19/22 celler i kliniske prøver ved hjælp af et Biotin-SP-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG, F (ab') 2 Fragment Specific (Jackson ImmunoResearch, USA) og PE Streptavidin antistof (BD Biosciences, USA). Haplo-TanCAR-T 19/22 celler i kliniske prøver blev også målt ved hjælp af qPCR som beskrevet []. Omfanget af donor-graftment i kliniske prøver blev vurderet ved hjælp af short tandem repeat amplification og fluorescence labeling multiplex PCR kombineret med kapillærelektroforese som beskrevet []. Serum interleukin (IL)-2, IL-6, IL-8 og IL-10 samt niveauer af tumornekrosefaktor-α blev analyseret som beskrevet []. BM før haplo-TanCAR-T 19/22 celleprotokol viste overvejende blastceller med fravær af normale BM-forstadier. BM flowcytometri på dag 14 efter infusion af haplo-TanCAR-T 19/22 celler viste, at der var 0,73 % resterende marv-blastyper. Det skal bemærkes, at disse resterende leukemiske blastceller udviste ekspressionsmønsteret CD34+ CD10+ CD22+ CD38+ CD33+ CD19− CD20−, som ikke kunne påvises ved flowcytometri på dag 28 i mangel af yderligere behandling. I betragtning af det ufuldstændige opsving i blodpladetal og absolut neutrofiltal på dag 28, opnåede denne patient MRD-CRi på dag 28 efter infusion. Der var ingen tegn på blaster i BM ved hverken BM-smear eller flowcytometri ved efterfølgende tidspunkter i 14 måneder. BM havde rekonstitution af normal hæmatopoiese på dag 56 med undtagelse af blodpladetal, som stadig ikke var genoprettet på et niveau på 36 × 109/L på tidspunktet for denne rapport. Fuld donor-kimerisme blev etableret på dag 14 efter infusion og forblev stabil derefter. Efter infusion, ekspanderede haplo-TanCAR-T 19/22 celler og toppede på et niveau på 30,7 % af cirkulerende T-celler på dag 12 efterfulgt af en kontraheringsfase med et lavt niveau på 0,45 % af cirkulerende T-celler på dag 28. Dette faldt sammen med eliminationen af cirkulerende B-celler, som næsten ikke kunne påvises på dag 28 ved flowcytometri. Haplo-TanCAR-T 19/22 celler var stadig målbare med et lavt niveau på 2,29 % af cirkulerende T-celler og cirkulerende B-celler var stadig ikke kommet sig på tidspunktet for denne rapport. Haplo-TanCAR-T 19/22 celler var også til stede ved flowcytometri på alle tidspunkter for responsvurdering i BM opnået ved responsvurdering, og kronisk B-celle aplasi blev dokumenteret. En overordnet overensstemmelse mellem udvidelsen og persistensen af haplo-TanCAR-T 19/22 celler i PB målt ved flowcytometri og qPCR blev observeret. På tidspunktet for denne rapport, forblev TanCAR-19/22 DNA detekterbar ved qPCR med 1134 og 396 kopier pr. mikrogram DNA i PB og BM, henholdsvis. Efter infusion af haplo-TanCAR-T 19/22 celler oplevede han grad 3 CRS gradet efter UPenn-klassifikationsskalaen [, ]. Feber på op til 38,8 °C opstod inden for 24 timer efter infusion af haplo-TanCAR-T 19/22 celler og varede i 11 dage og blev afebril på dag 12 efter behandling med en lavere dosis af tocilizumab på 160 mg (1,6 mg/kg) og etanercept 50 mg på dag 8. Flere serum cytokiner var markant forøget 7 dage efter infusion og blev næsten vendt tilbage til baseline værdier på dag 41, hvor interleukin (IL)-6 niveauer toppede på 3377 pg/mL (88 gange over baseline) på dag 11. Aspartat aminotransferase og lactat dehydrogenase var signifikant forhøjet 8 til 10 dage efter infusion, toppede på 1529,1 U/L (38 gange over øvre normalgrænse) og 2027,8 U/L (13 gange over baseline) på dag 12, og vendte tilbage til baseline værdier på dag 21 med den bedste understøttende behandling. Han udviste også koagulationsdysfunktion med forlænget aktiveret partiel tromboplastin tid, forhøjet D-dimer og faldne fibrinogen koncentrationer samt kapillær lækage med grad 2 hypoalbuminæmi på trods af intensiv tilskud af protein under CRS, som blev løst på dag 23. Den tidligere fase 3 hudakut GVHD, som var under kontrol, blev reaktiveret og udviklede sig hurtigt til fase 4 hud GVHD med nye lokale hudulcerationer, særligt i pungen og i mundslimhinden 11 dage efter infusion af haplo-TanCAR-T 19/22-celler. Serumets totale bilirubin steg konstant fra dag 12 og steg til 134 μmol/L på dag 21. På grund af de hurtigt progressive hud GVHD-manifestationer og leverpåvirkning blev methylprednisolon med lavere dosis på 20 mg dagligt som den indledende dosis med efterfølgende reduktion i et forsøg på at afbalancere fordelene og risiciene ved systemisk immunosuppression implementeret fra dag 21 og afbrudt på dag 39. Hududslæt og serumets totale bilirubin blev forbedret betydeligt efter disse behandlinger. Dog opstod der fase 3 tarm GVHD-manifestationer, herunder hovedsageligt diarré fra dag 50, og serumets totale bilirubin steg igen, hvilket antydede en grad 3 akut GVHD. Seksten doser methylprednisolon 20 mg pr. dag blev administreret igen fra dag 78, hvilket kontrollerede diarré og serumets totale bilirubin betydeligt. Denne patient udviste efterfølgende moderat kronisk GVHD, der hovedsageligt manifesterede sig som scleroderma, diarré og vægttab. Vedvarende trombocytopeni med et antal blodplader fra 15 × 109 til 43 × 109/L uden transfusion af blodplader kunne anerkendes som en manifestation af kronisk GVHD i forbindelse med rekonstitution af normal hæmatopoiese. Den systemiske immunosuppressive behandling blev reduceret inden for 2 måneder med methylprednisolon 4 mg hver anden dag og methotrexat 5 mg én gang om ugen og sirolimus 1 mg dagligt som en minimumsvedligeholdelsesdosis fra dag 154 til tidspunktet for denne rapport, hvilket holdt den kroniske GVHD under god kontrol.