En 47-årig kvinde (vægt: 62 kg) blev diagnosticeret med kronisk aktiv HBeAg-positiv hepatitis B i 1996. Virale parametre såsom HBeAg, anti-HBe IgG og HBV plasma viral load fra frosne prøver blev samtidigt målt af en unik operatør for at reducere intra- og inter-assay variationer. HBeAg og anti-HBe blev bestemt ved elektrokemiluminescens (ELECSYS 2010, Roche Diagnostic). HBV viral load niveauer blev bestemt ved real time PCR (COBAS TaqMan Roche Molecular Systems, dynamisk område 30 IU/ml til 110,000,000 IU/ml) []. Lever inflammation blev målt ved serum alanin aminotransferase (ALT) niveauer. Til sekvensanalyse blev HBV pol- og preC-core-gener sekvenseret med primere som beskrevet tidligere []. Analysen blev udført ved hjælp af et ABI3100-instrument (Applied Biosystems), og sekvenserne, der blev introduceret i dette arbejde, samt dem, der blev opnået fra GenBank-databasen, blev justeret med ClustalX v1.83 [] og redigeret med Bioedit v7.0.9.0 [] HBV-genotypen blev vurderet ved hjælp af fylogenetisk inference ved hjælp af Neighbor-joining algoritmen med Kimura-to-parameter modellen af molekylær evolution i MEGA v3.1 software [] Sekvenser fra begge gener blev opnået på forskellige tidspunkter under antiviral behandling. En mere detaljeret HBV pol-gen klonal analyse blev udført på syv udvalgte virusisolater fra serumprøver høstet under sekventielle behandlinger. Hvert udvalgte PCR produkt af pol-gen blev klonet i pGEM-T Easy vektor i henhold til producentens instruktioner (Promega, Wisconsin, USA) og mindst 15 kloner blev yderligere analyseret ved sekventering. Dette tillod analyse af udviklingen af virus-quasispecies under den successive antivirale pres baseret på analyse af pol-gen. Anti-HBV-behandlingsinterventionerne ledsaget af HBV-viral belastning og ALT-niveau kinetik er afbildet i figur. Terapi blev indledt, da HBV-viral belastning steg til 6,5 × 106 IU/ml. I 1998, da patienten blev behandlet med IFN-a 5 MU tre gange ugentligt i 30 uger, var HBV DNA-niveauet lavere end detektionsgrænsen. Denne behandling blev afbrudt og erstattet i 1999 af lamivudin (150 mg én gang dagligt). Efter 2 års kontinuerlig behandling var HBV DNA detekterbar (15,5 × 106 IU/ml). HBeAg forblev negativ med detekterbar anti-HBe i denne behandlingsperiode. I 2001, efter en 6 måneders afbrydelse, viste HBV DNA-niveauet en post-behandlingsflare (1 × 108 IU/ml). I slutningen af 2003 blev lamivudin-terapi genindført (150 mg én gang dagligt). Det blev ledsaget af en sjælden begivenhed af revertering til en HBeAg-positiv/anti-HBe negativ profil, som forblev detekterbar i to år. Viral belastning nåede 3,1 × 106 IU/ml på dette tidspunkt. Ti måneder senere, i 2006, blev lamivudin-regimet erstattet af adefovir monoterapi (10 mg/dag). I starten var virusbelastningsniveauerne lave (8,5 × 104 IU/ml), men efter 48 ugers behandling nåede disse niveauer 7,15 × 106 IU/ml. ALT-niveauerne var normale i dette interval. Reaktivering af HBV-replikation blev antaget i betragtning af den samtidige påvisning af HBeAg/anti-HBe [] og den høje replikation, der blev påvist. Sammenslutningen af HBeAg og anti-HBe forekommer ikke at være ualmindeligt blandt antiviral behandling-naive patienter, men dens udbredelse hos behandling-erfarne patienter er ukendt. Dette serologiske mønster har været relateret til omfattende hepatocyt-skade og alvorlig immun-medieret leverskade og deraf følgende dysfunktion []. Seks måneder senere, steg ALT-niveauet lidt (1,5 × øvre normalgrænse - UNL -), og entecavir monoterapi blev indført (1 mg dagligt). Efter 5 måneders entecavir monoterapi blev tenofovir (300 mg én gang dagligt) tilføjet til behandlingsprogrammet for dobbeltterapi. HBV DNA faldt til 1 × 105 IU/ml i fire måneder, men tre måneder senere nåede virusbelastningen > 1,1 × 108 IU/ml. Endvidere viste en stigning i ALT-niveauet (20 × UNL) leverbetændelse. I løbet af de følgende 48 uger faldt virusreplikationen lidt til 6,1 × 106 IU/ml, men steg igen først til 3,6 × 107 IU/ml og senere til > 1,1 × 108 IU/ml. For nylig (andet halvår 2010) svingede HBV DNA-niveauerne mellem 4,3 × 104 IU/ml og 4,9 × 107 IU/ml. Ved slutningen af opfølgningen af studiet kunne vi måle tenofovir-koncentrationen i plasma ved høj-kapacitet-væskekromatografi i tre på hinanden følgende prøver 20 timer efter administration, og den nåede 71,6 ng/ml ± 47,6 (middel ± SD). ALT-AST-niveauerne forblev lidt forhøjede (2 x UNL) i de sidste to års opfølgning. HBV-isolater fra patienten blev tilskrevet genotype A2 baseret på fylogenetisk beslægtethed blandt delvise HBV genomiske sekvenser fra både pol- og preC-C-gener. En yderligere langsgående genotypisk analyse, herunder kvasispecies-sammensætning af HBV-stammer isoleret fra patienten, afslørede tilstedeværelsen af resistensmutationer baseret på pol-gensekvenser (tabel). I begyndelsen af lamivudinbehandlingen var HBV vildtype i alle kloner. Efter 2 år under en sådan behandling blev denne viruspopulation fuldstændigt erstattet af mutation rtM204I - homogen udstilling af lamivudinresistens. Når denne behandling blev afbrudt i 6 måneder, bestod kvasispecies-sammensætningen næsten udelukkende af vildtype pol-nukleotidsekvenser, bortset fra et mindre bidrag (< 10%), der viste adefovir-resistens-associeret mutation I233V. Når lamivudinbehandlingen blev genindført, og indtil entecavir plus tenofovir blev administreret, blev de to lamivudin-resistens-associerede mutationer rtL180M og rtM204I uændret påvist. Under den sidstnævnte terapeutiske ordning blev kun ephemeralt og med mindre bidrag (< 10%), A181T og T184L lamivudin-adefovir og entecavir-resistens-associerede mutationer påvist. Derudover blev der påvist yderligere to varianter i det katalytiske domæne i revers transkriptase på tidspunktet for lamivudinresistens. Disse rtA200V- og rtI253V-varianter forblev til stede under entecavir-behandling og blev også påvist i prøver, der blev sekventeret efter gennembrud under entecavir-behandling. HBV-genomkarakteriseringen på preC-C-niveau viste tilstedeværelsen af A1762T og G1764A dobbeltmutation, som blev opdaget tidligt, da patienten ikke var i behandling, og som forblev i denne tilstand under hele opfølgningen. T1753C-mutationen blev også konsekvent opdaget. Tilstedeværelsen af disse kernepromotor-mutationer er også relateret til den ovennævnte HBeAg-antiHBe-samtidige profil, som blev fundet hos denne patient, som rapporteret for nylig [].