En 73-årig mandlig patient blev henvist fra sin tandlæge til yderligere evaluering af en hvidlig læsion på den fastgjorte gingiva og tilhørende peri-implantitis. Et panoramisk billede viste generaliseret tab af alveolær knogle og aflejring af kalk i peri-implantatområdet (#42, #43, #44), og det højre mandibulære forreste område og præmolarområdet viste peri-implantat-krestal knogletab. Laboratoriefundene var inden for normalområdet. Andre flere situationer med forhøjede niveauer af onkogeniske proteiner, herunder brug af tobak og/eller alkohol, ingen ernæringsmæssige mangler, ingen fund af eksponering for ioniserende stråling, ingen immundefekt eller immunosuppressiv behandling og andre irritationer fra aftagelige proteser, blev alle udelukket. En hvidlig læsion blev fjernet, og prøven blev sendt til en oral patolog. Den forurenede implantatoverflade blev behandlet med en laser. Den patologiske diagnose blev bekræftet som oral candidiasis. Patienten gennemgik laserbehandling tre gange for at behandle peri-implantitis-læsionen. Et år senere blev hans implantat i #42, #43 og #44 fjernet på grund af peri-implantitis på den lokale klinik. Fra den lokale kliniks henvisning blev implantatsystemet beskrevet som en intern friktionskontakttype med en SLA-overflade, som var installeret i mere end 10 år. Omkring 3 år efter laseroperationen blev der fundet en bulende masse på den lingale side af #43 og #44 området. En incisional biopsi blev udført og blev diagnosticeret som en SCC. Yderligere undersøgelser blev udført herunder laboratorieundersøgelser, røntgenbilleder af brystet, EKG, MRI, kontrast CT, PET-CT og nakke sonografi. Patienten blev diagnosticeret med cT4aN2cM0 fase IVA i henhold til TNM-stadieringssystemet foreslået af American Joint Committee on Cancer (AJCC, 2018). Han blev straks planlagt til en operation, der omfattede selektiv hals dissektion, mass resektion med marginal mandibulektomi og rekonstruktion med en radial underarm fri lap. Den endelige patologiske rapport var veldifferentieret pladecellecarcinom med en 1,5 × 2,0 cm størrelse af tumor, ingen metastase til nogen af de 27 regionale lymfeknuder og klar kirurgisk resektionsmargen. Vaskulære og perineurale invasioner blev ikke observeret; således blev han diagnosticeret som pT1N0M0, fase I. Specielt, i stedet for på grænsefladen mellem implantatet og knoglen, forekom tumorceller på overfladen af det mucosale bløde væv først og trængte dybt langs implantattrådene. Hverken adjuverende strålebehandling eller kemoterapi blev administreret til patienten. En metastatisk lymfeknude blev fundet på det højre ipsilaterale niveau IV på en CT-skanning taget 4 måneder efter operationen. Der blev udført en selektiv halsudskæring, herunder højre niveau IV, og en nyudviklet mistænkt for ondartet læsion blev fundet på højre kæbe. Patientens kæbelæsion blev bekræftet som SCC ved incisional biopsi; derfor gennemgik han en yderligere operation 13 dage efter den anden selektive halsudskæring. Den endelige patologiske rapport om kæbelæsionen var veldifferentieret SCC med en 2,0 × 1,4 cm stor tumor; invasionsdybden var 0,7 cm. Involvering af underliggende knogle var til stede. De kirurgiske resektionsmarginer var klare. De kirurgisk fjernede prøver blev fikseret i 10 % neutral bufferformalin, behandlet efter en rutinemæssig protokol, og der blev også fremstillet serielle mikrotilskæringer med forskellige antistoffer til immunhistokemisk farvning. Alle patientens datafiler blev udvalgt fra filerne fra afdelingen for oral og maxillofacial kirurgi, Seoul National University Dental Hospital under godkendelse fra Seoul National University's institutionelle bedømmelseskomité (S-D20170026). Patientens blod blev opsamlet før operationen, 10 dage efter operationen og 3 måneder efter operationen. Efter præcipitering ved stuetemperatur blev prøverne centrifugeret ved 4000 rpm i 20 minutter. Kun supernatanten blev opsamlet og blandet med lysisbuffer og brugt til IP-HPLC. Vi anvendte 100 μg af hvert protein-ekstrakt til immunpræcipiteringsproceduren ved hjælp af en protein A/G agarosekolonne (Amicogen Co., Korea). Protein A/G agarosekolonnerne blev separat præ-inkuberet med 1 μg af hver af de 20 forskellige antistoffer, herunder p53, muc1, muc4, TGF-β1, survivin, Wnt1, E-cadherin, β-catenin, matrixmetalloproteinase (MMP)-3, MMP-10, TNFα, HER1, HER2, PAI-1, NRAS, KRAS, CEA, Met, FASL og ERb. Kort fortalt blev proteinprøverne blandet med 5 ml bindingsbuffer (150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,2 mM natriumvanadat, 0,2 mM PMSF og 0,5 % NP-40) og inkuberet i protein A/G agarosekolonnerne ved 10 °C i 1 time. Kolonnerne blev placeret på en roterende omrører under inkubationen. Efter vask af hver kolonne med en tilstrækkelig mængde PBS-opløsning (pH 7,3, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 43 mM Na2HPO4-7H2O og 1,4 mM KH2PO4) blev målproteinet elueret med 150 μl IgG-elutionsbuffer (Pierce Co., USA). De immunpræcipiterede proteiner blev analyseret ved hjælp af HPLC (1100 series® Agilent, USA) ved hjælp af en reversfase-kolonne og et mikroanalytisk detektorsystem (SG Hightech Co., Korea), der blev betjent med 0,15 M NaCl og 20 % acetonitrilopløsning ved 0,4 ml/min i 30 min, og analyseret via UV-spektroskopi ved 280 nm. I IP-HPLC-resultaterne blev prøveproteinets topareal, der blev opnået fra HPLC-analysen i den negative kontrol, brugt til at eliminere antistoftoparealet (mAU*s) [–]. For at sammenligne serumprotein før og efter operationen blev proteinets topareal proportionelt normaliseret med a-tubulinværdien og plottet som en bjælke. Proteinekstrakter blev fremstillet fra tumorvæv, 100 μg af hver proteinekstrakter til immunpræcipiteringsproceduren ved hjælp af en protein A/G agarosekolonne. Protein A/G agarosekolonnerne blev individuelt præ-inkuberet med 1 μg af hver af de 9 forskellige antistoffer, herunder TNFα, NRAS, HER2, Met, E-cadherin, p53, survivin, TGF-β1 og NFκB. Kort fortalt blev proteinprøverne blandet med 5 ml bindingsbuffer (150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,2 mM natriumvanadat, 0,2 mM PMSF og 0,5% NP-40) og inkuberet i protein A/G agarosekolonnene ved 10 °C i 1 time. For at sammenligne proteinområdet for normal gingiva og SCC-væv blev proteinpeaketværdien proportionelt normaliseret med alfa-tubulinværdien og plottet som en bjælke. Laboratorieprøver blev indsamlet rutinemæssigt, herunder komplet blodtælling (CBC) med differentieret tælling, C-reaktivt protein (CRP) niveauer og erythrocyt-sedimentationshastighed (ESR). En moderat stigning i plasma CRP i det område, der observeres hos tilsyneladende raske individer, er en stærk indikator for fremtidige vaskulære hændelser []. Chen et al. [] rapporterede, at tilstedeværelsen af forhøjede præoperative serum CRP niveauer (> 5,0 mg/L) er en uafhængig prognostisk indikator for oral cancer. Resultaterne fra blodprøveprøverne blev sammenlignet fra det første besøg, præoperativt, postoperativt og på tidspunktet for tilbagefald. IP-HPLC-analyserne afslørede, at p53, E-cadherin, β-catenin, MMP-10, HER2, NRAS, Met og ERb var faldet på postoperativ dag 10. Andre proteinmarkører relateret til onkogen signalering var steget på postoperativ dag 10. Dette antyder, at onkogeniske proteiner, såsom p53, E-cadherin, β-catenin, MMP-10, HER2, NRAS, Met og ERb blev frigivet fra den primære tumor; derfor faldt serumniveauerne af disse onkogeniske proteiner efter tumor-ablativ kirurgi. I 3 måneder postoperativt ved brug af patientens serum var alle onkogeniske proteinmarkører forhøjet, og der var mistanke om tumor-tilbagefald eller metastase. IP-HPLC-analyser afslørede, at NRAS, Met, p53 og NFκB blev overudtrykt i SCC-vævet ved sammenligning af onkogene proteinniveauer mellem normalt gingiva og SCC-væv, absolut neutrofiltal (ANC), ESR og CRP var forhøjede umiddelbart efter operationen. CRP blev ikke målt før operationen, og derfor kan disse data ikke sammenlignes med andre tidspunkter. CRP-niveauerne havde dog ikke ændret sig væsentligt før og efter den anden operation (højre niveau IV selektiv halsudskæring, yderligere fil: figur S1). ESR-tal var forhøjede i den præoperative periode, som bestemt, da en malign læsion blev bekræftet ved incisional biopsi og sammenlignet med en prøve taget ved det første besøg. Det indikerer, at nogle inflammatoriske reaktioner kan påvirke potentialet for malign transformation. Perioperative ændringer i RBC'er, hæmoglobin, hæmatokrit viste, at niveauerne blev nedsat under postoperationen, men havde tendens til at komme sig over tid (Supplerende fil: Figur S2). Andelen af segmenterede neutrofiler steg umiddelbart efter operationen, som er karakteristiske celler af akutte inflammatoriske reaktioner, fordi de flyttede til det kirurgiske sår umiddelbart efter traume i flere minutter. De kurver, der blev tegnet for lymfocyt-, monocyt-, eosinofil- og basofilniveauer, viste modsatrettede tendenser fra de segmenterede neutrofilniveauer (Supplerende fil: Figur S3).