Pacientkou je dívka, nyní 11 let, která se narodila o tři týdny předčasně císařským řezem kvůli transverzální poloze, porodní hmotnost 2720 g. V kojeneckém věku ani později nebyly problémy s krmením. Motorický a jazykový vývoj byl opožděný: bez podpory chodila ve věku 2,5 roku a ve věku 3 let řekla první slova. Ve věku 10 let znala abecedu a zkoušela skládat písmena dohromady. Do věku 8–9 let používala plenky. Její spánek je mírně nepravidelný s častými probuzeními. Nikdy nebyly zjištěny vrozené vady nebo epilepsie. Má normální postavu s délkou podél 25. až 50. percentilu a hmotnost podél 25. percentilu, ale obvod hlavy byl v dolním normálním rozmezí (2,5. až 5. percentil). Její obličejové rysy jsou také normální – není zřetelně dysmorfní. Chování je normální bez autistických rysů, ale bruxismus je problém. Dává přednost společnosti mladších dětí. Její intelektuální úroveň je hodnocena jako srovnatelná s mírnou až středně těžkou ID, formální testování IQ ještě nebylo provedeno. Ve věku 9 let bylo provedeno sekvenování celého exomu (WES), které porovnalo DNA dítěte s DNA rodičů, a bylo odhaleno de novo NAA10 (NM_003491.3) c.332 T > G p.V111G varianta, která byla dále potvrzena sekvenováním Sangerem. V souladu s ostatními missense variantami NAA10 ovlivňuje substituce V111G vysoce konzervovanou aminokyselinu (obr., panely A a B). NAA10 je protein o 235 aminokyselinách, který přizpůsobuje charakteristický GNATový záhyb společný katalytickým podjednotkám NAT. Tento záhyb se skládá ze šesti nebo sedmi β-řetězců a čtyř α-helic (obr.). β-řetězce 2-5 tvoří jádro proteinu. Tyto čtyři β-řetězce spolu s α2-helic a β6-β7 smyčkou důležitou pro vazbu substrátu jsou vysoce konzervovány. V111 je umístěn ke konci β5-řetězce a valin v této pozici je vysoce konzervován v homologii NAA10 i v několika dalších katalytických podjednotkách NAT, pro které byly rozřešeny krystalické struktury (obr., data nejsou znázorněna (PDB ID: 5K04 (NAA20), 4U9W (NAA40), 3FTY (NAA50), 5ICV (NAA60) a 4LX9 (ssNAT)) [–]. Boční řetězec V111 tvoří hydrophobickou kapsu spolu s Y145, M147, L119 a L109. Je také v těsné blízkosti (3,7 Å) k sírové skupině Acetyl-CoA (AcCoA), což by mohlo naznačovat roli V111 v pozici AcCoA (obr.). Glycin v této pozici nezpůsobuje žádné sterické kolize, ale ztráta objemnější hydrophobické boční řetězce valinu může případně způsobit strukturální změny ovlivňující stabilitu proteinu nebo vazbu AcCoA. K funkčněmu posouzení NAA10-V111G jsme nejprve v E. coli vyjádřili His/MBP-NAA10-WT a His/MBP-NAA10-V111G, purifikovali enzymy a testovali in vitro NAT aktivitu. Na rozdíl od His/MBP-NAA10-WT bylo obtížné získat dobrou expresi bílkoviny His/MBP-NAA10-V111G a podstatná část purifikovaných molekul His/MBP-NAA10-V111G se eluovala do volného objemu kolony chromatografie s vyloučením velikosti (obr., panely A a B). To naznačuje, že části bílkovinného agregátu jsou větší než 200 kDa, nejspíše kvůli změně struktury bílkoviny nebo snížené stabilitě bílkoviny. Enzymy, které se eluovaly do objemu kolony odpovídajícího monomerní His/MBP-NAA10-V111G, byly testovány na katalytickou aktivitu a bylo prokázáno, že mají přibližně 85% snížení katalytickou aktivitu ve srovnání s His/MBP-NAA10-WT (obr., panely C a D). Vzhledem k nízké expresi a výtěžku bílkoviny NAA10-V111G z transfekce E. coli a purifikace bílkoviny transfekovali jsme buňky HeLa plazmidy kódující buď V5-tagged NAA10-WT nebo V5-tagged NAA10-V111G následovanou imunoprecipitací (IP) nadměrně exprimované bílkoviny pomocí anti-V5 protilátky. Poté byla měřena aktivita NAT v precipitátu (obr. ). NAA10 a NAA15 tvoří vysoce afinitní proteinový komplex (obr. ), a jak se očekávalo, endogení NAA15 byl ko-imunoprecipitován jak s nadměrně exprimovanou bílkovinou NAA10-WT-V5, tak s NAA10-V111G-V5. Množství přítomné bílkoviny NAA10 a NAA15 v každém vzorku bylo stanoveno pomocí SDS-PAGE a Western blotu. Pruhy z Western blotu byly kvantifikovány a měřená katalytická aktivita byla korelována s množstvím přítomné bílkoviny NAA10-V5 (tj. směsi monomerní NAA10 a NAA10 v komplexu s NAA15 – NatA komplex) a samostatně korelována s množstvím přítomné bílkoviny NAA15 (tj. množství NatA komplexu) v každém vzorku. Výsledky experimentu s IP-aktivitou dobře korespondovaly s našimi předchozími zjištěními (obr. ): schopnost NAA10-V111G acetylovat kyselou N-terminální část EEEI24 byla výrazně snížena (obr., panely B a C). Nicméně byl také zjištěn druhý zajímavý rys: Jak je patrné z Western blotu na obr., více NAA15 bylo ko-imunoprecipitováno s NAA10-V111G-V5 ve srovnání s NAA10-WT-V5. To se také odrazilo v našich měřeních NAT-aktivity, kde imunoprecipitovaná vzorka NAA10-V111G-V5 vykazovala vyšší tvorbu NatA produktu (pro NatA substrátový polypeptid SESS24) ve srovnání s imunoprecipitovanou vzorkou NAA10-WT-V5 při korelaci množství celkového přítomného NAA10-V5 (obr. ). Nicméně při korelaci množství přítomné bílkoviny NAA15 v každém vzorku bylo množství NatA produktu na bílkovinu NAA15 (a tedy NatA komplex) přibližně stejné (obr. ). Vzhledem k tomu, že monomerní NAA10 má 1000krát nižší NAT-aktivitu vůči NatA substrátům ve srovnání s NatA komplexem [], je příspěvek monomerní NAA10 na acetylování SESS24 minimální. Vezmeme-li to vše v úvahu, naznačuje to, že NAA10-V111G má sníženou katalytická aktivitu v monomerní formě, ale ne v komplexu s NAA15. K posouzení výměny proteinů NAA10-WT a NAA10-V111G jsme vyjádřili V5-tagged NAA10-WT a NAA10-V111G v buňkách HeLa a provedli jsme cykloheximidové experimenty. Jak je vidět z obrázku, NAA10-V111G-V5 má vyšší rychlost výměny než NAA10-WT-V5. 2 hodiny po ošetření cykloheximidem se průměrné množství NAA10-V111G-V5 snížilo přibližně o 80 %, zatímco molekuly NAA10-WT-V5 se snížily o 20 % ve srovnání s množstvím molekul NAA10 před ošetřením cykloheximidem. Ačkoli se množství NAA10-V111G-V5 po 2 hodinách drasticky snížilo, zdá se, že se hladina NAA10-V111G-V5 stabilizuje na přibližně 20 %. Nejpravděpodobněji je nadměrně exprimovaný NAA10-V111G-V5 přítomen jak v nestabilní monomerní formě, která je rychle degradována, tak ve spojení s NAA15, která stabilizuje enzym a chrání jej před degradací.