74letý muž se v srpnu 2006 dostavil ke svému praktickému lékaři s potížemi s pamětí a byl poté odeslán k neurologovi. Projevil rychlý globální kognitivní pokles spojený s agresivitou, bizarním chováním a ztrátou řeči. To bylo doprovázeno závažnou anomií, rozvolněním zábran a skóre 10/30 na MMSE. Nebyly žádné fokální příznaky, myoklonus nebo ataxie. Klinické zhoršení bylo velmi rychlé a v prosinci 2006 byl pacient v akineticko-mutistickém syndromu s abnormálním držením těla. Dvě snímky z magnetické rezonance (MRI) z října a prosince 2006 včetně sekvencí T1, T2, FLAIR a DWI ukázaly mírné známky mozkové atrofie, ale žádný nárůst abnormálního kortikálního nebo bazálního gangliového signálu. Elektroencefalogram (EEG) nebyl diagnostický a hladina proteinu 14-3-3 v mozkomíšním moku (CSF) byla normální. Pacient zemřel v březnu 2007. V rodinné anamnéze demence byl 80letý bratr s diagnózou pravděpodobné Alzheimerovy choroby. Po sekvenování genu prionového proteinu (PRNP) nebyly nalezeny žádné mutace v otevřeném čtecím rámci. V kodonu 129 byla nalezena methioninová varianta (MV). Moderní až mírné spongiformní změny byly přítomny v mozkové kůře, putamenu/globus pallidus a thalamu, přičemž léze byly zjevnější v putamenu a frontální kůře (obrázek a). Slučující se vakuoly nebyly nalezeny v žádné oblasti. Kromě několika fokálních vakuol v hlubší molekulární vrstvě byla cerebelární kůra jinak nezřetelná (obrázek). Neurony byly převážně zachovány v mozkové kůře a bazálních gangliích, ačkoliv bylo zřídka pozorováno fokální astrogliózu (obrázek). Mírné až středně závažné mikrogliózy byly přítomny v mozkové kůře a bazálních gangliích a podkorové bílé hmotě (obrázek a). Imunostahování PrP bez pre-terapie proteinázou K ukázalo silnou stahování charakterizovanou jemnými tečkovými depozity (synaptickými) a nepravidelnými granulárními, často spojitými depozity, které bylo možné kategorizovat jako difuzní synaptické (obrázek a). Perineurální a cerebelární plaky, plaky kuru a kvetoucí plaky chyběly. Po pre-terapii PK zmizela velká většina stahování, s výjimkou několika granulárních depozitů PrP rezistentních na PK (obrázek a). Mozek vykazoval diskrétní synaptický vzor v molekulární a granulární vrstvě, který po pre-terapii PK zmizel. Citlivost na pre-terapii PK byla nejlépe vizualizována v po sobě jdoucích sekcích s pre-terapií PK a bez ní (obrázek). Paralelní sekce obarvené protilátkou 3F4 ukázaly výrazné snížení imunoreaktivity PrP, jak bylo vyhodnoceno denzitometrií, zahrnující 70-80% celkové PrP v mozkových sekcích. To bylo dále potvrzeno inkubací mozkových sekcí protilátkou 1E4 a porovnáním imunohistochemického vzoru PrP jednoho případu s probandem. Jak je ukázáno na obrázku, synaptická imunoreaktivita PrP 3F4 a 1E4 v běžném případě MV1 ukázala rezistentní imunoreaktivitu PrP (obrázek). Na rozdíl od toho byla imunoreaktivita 3F4 a 1E4 prakticky zrušena po pre-terapii PK v probandovi (obrázek). Kromě těchto změn byly v entorhinální a perirhinální kůře, subikulu a CA1 a CA3 oblastech hipokampu přítomny neurofibrilární spleti a předpleti, jakož i granule (zrníčka). Několik předpleti a zrníček bylo také vidět v amygdale. Tyto změny byly doprovázeny několika hyperfosforylovanými depozity tau v neuronech dentátové gyru, spirálovitých tělech v bílé hmotě temporálního laloku a peri-ventrikulárních astrocytech. V entorhinální kůře a amygdale byly přítomny rozptýlené aB-crystallin-imunoreaktivní balastní neurony. Tau patologie byla v souladu se stádiem Alzheimerovy choroby III a s argyrofylickým zrnitým onemocněním stádium 3. Amyloidní plaky a a-synukleinové inkluze chyběly. Nebyly nalezeny žádné abnormality s protilátkami proti TDP-43. Standardní postup Western-blot (10% homogenát mozku a konečná koncentrace PK 440 μg/ml) nedokázal detekovat PrPSc. Zvýšení objemu naloženého do gelu z 5 na 10 μl přineslo extrémně slabý signál odpovídající 24 a 19 kDa při expozici filmu po dobu saturace (obrázek). Snížení koncentrací PK (440, 100 a 50 μg/ml) ukázalo nárůst signálu PrPSc, což naznačovalo PK-citlivý prionový protein (obrázek). I tak byly viditelné pouze dvě pásma 24 a 19 kDa. Po zvýšení procenta homogenátu mozku na 20% byl získán stejný dvoupásmovém vzor. Používáním kitu TeSeE®, který se vyznačuje měkčími podmínkami pro štěpení PK následovanými kroky čištění a koncentrace proteinu a barvením s Sha31 Mab, byla odhalena přítomnost dvou neočekávaných pásem 21 a 16 kDa (obrázek). Tento profil pásem byl pozorován ve všech oblastech mozku a představoval pozoruhodný výsledek, protože jejich molekulová hmotnost byla odlišná od hmotnosti dříve zjištěné pomocí Mab 3F4 a 6H4. Provedení kombinace štěpení, čištění a koncentrace vzorku podle doporučení kitu TeSeE® spolu s detekcí pomocí 3F4 a 6H4 přineslo nový vzor. V každé z těchto vzorků byly přítomny nejen předchozí pásy 24, 21, 19 a 16 kDa, ale v některých oblastech mozku byl také pozorován velmi slabý pás 28 kDa a fragment o velikosti přibližně 6kDa (obrázek). Dále byly získány rozdíly intenzity signálu pomocí protilátek 3F4 a 6H4, což naznačuje rozdílnou afinitu k PrPSc, kterou lze interpretovat jako odlišnou konformaci proteinu, kdy byl epitop vázající se na 3F4 více exponován než epitop vázající se na 6H4. Analýza deglykosylace odhalila tři aglykosylované izoformy o velikosti 19, 16 a 6 kDa, které byly intenzivnější v kortexu (parietální, frontální a temporální) a slabší v okcipitálním kortexu a putamenu/globus pallidus. V oblasti talamu byly detekovány dvě pásma, intenzivnější o velikosti 19 kDa a slabší o velikosti 16 kDa. Nakonec, cerebellum byl jedinou oblastí, kde bylo pozorováno jediné aglykosylované pásmo o velikosti 19 kDa (obrázek), podobně jako u typu 2 sCJD. Nicméně, nemůžeme vyloučit možnost, že tento nález byl výsledkem přítomnosti malého množství PrPSc a nedostatečného zastoupení ostatních pásem, jak bylo pozorováno v talamu, kde bylo 16 kDa pásmo pozorováno pouze při delším čase expozice filmu. Hodnocení citlivosti na PK trávení bylo dosaženo měřením absorbance PrPSc před a po ošetření proteinázou K pomocí testu IDEXX HerdChek BSE. Tato technologie je založena na selektivním zachycení PrPSc specifickým chemickým polymerem prostřednictvím polyionických interakcí v přítomnosti PrPC z homogenátu mozku. Hodnoty absorbance se snižují se sériovými ředěními, takže lze předpokládat, že množství PrPSc je přímo úměrné absorbanci. Cílem tohoto protokolu bylo provést relativní kvantifikaci PrPSc bez ošetření proteázami. Domníváme se, že zavedení fáze trávení může být užitečné pro snadné vyhodnocení relativní odolnosti vůči PK trávení. Výsledky ukázaly, že hodnoty absorbance se po ošetření PK snížily ve všech vzorcích (tabulka). Pro multi-infarktovou encefalopatii (MIE) a sCJD VV2 bylo snížení signálu sníženo o 4,32 % a 2,02 %, ale snížení nebylo statisticky významné. Naproti tomu vzorky z probandů a sCJD MM1 vykazovaly statisticky významné (p < 0,005) snížení signálu o 79,82 % a 22,68 %. Hodnoty absorbance pro MIE byly pod mezní hodnotou, na stejné úrovni jako negativní kontroly. Zbývající hodnoty byly nad mezní hodnotou. Tyto rozdílné úrovně redukce signálu ukazují na tři úrovně odolnosti vůči PK trávení: vysokou, střední a nízkou. Vysoká odolnost vůči PK trávení by byla indikována nízkým procentem redukce signálu, jak bylo pozorováno u sCJD VV2. V tomto případě by redukce signálu o 2 % naznačovala, že PK trávení degraduje pouze minimální podíl PrPSc, což by naznačovalo vysokou odolnost abnormálního prionového proteinu. Střední odolnost by byla indikována mírně vyšším procentem redukce signálu, jak bylo pozorováno u sCJD MM1, kde 22 % by poukazovalo na vyšší degradovatelný podíl PrPSc než byl pozorován v předchozím případě. To by představovalo typ proteinu, který je pouze mírně citlivý na degradaci proteázami, v závislosti na oblasti mozku. Další výzkumy jsou prováděny s cílem objasnit, zda je tato úroveň degradace spojena s typem proteinu MM1 nebo s fenoménem specifickým pro tento subjekt. Konečně, nízká odolnost vůči PK trávení by byla indikována vysokým procentem redukce signálu, například 79 % pozorovaných u probanda, což naznačuje, že je degradovatelný vysoký podíl PrPSc. To naznačuje existenci typů abnormálních prionových proteinů, které jsou extrémně citlivé na degradaci proteázami, což by mohlo být potenciálně přehlédnuto detekčními metodami založenými na charakteristické rezistenci na proteázu patologického prionového proteinu.