11letý neporušený německý ovčák (GSD) byl předán na pohotovost oddělení klinických věd pro zvířata v zájmovém chovu na Fakultě veterinární medicíny Utrechtské univerzity s dvoudenní historií náhlého nástupu dušnosti a celkové slabosti. Pravidelně se provádělo očkování a odčervení. Pes navštívil jižní Evropu 6 měsíců před prezentací. Před rozvojem klinických příznaků nebyly podány žádné léky a nebyly hlášeny žádné okolnosti prostředí, které by mohly způsobit dušnost (např. tabák, expozice organickým rozpouštědlům, prach). Fyziologické vyšetření ukázalo reagujícího, ale letargického psa s generalizovanou slabostí, těžkou dušností, cyanotickými sliznicemi, prodlouženým časem kapilárního naplnění, slabými periferními pulzy, tachykardií (srdeční frekvence 180 tepů/min) a systolickým šelestem stupně 1 ze šesti s maximálním bodovým číslem nad pravým srdečním vrcholem. Při plicní auskultaci byly slyšeny drsné plicní zvuky. Kompletní krevní obraz (CBC) ukázal mírnou zralou leukocytózu (bílé krvinky: 18,9 × 109/l; referenční interval 4,5–14,6 × 109/l) a hematokrit 56 % (referenční interval 42–61 %). Biochemie neprokázala žádné abnormality. Analýza arteriálního krevního plynu ukázala těžkou hypoxémii (PaO2: 48,5 mm Hg; referenční interval 85–103 mm Hg) a mírnou hypokapnii (PaCO2: 27,0 mm Hg; referenční interval: 32–43 mm Hg). Předpokládanou příčinou hypokapnie byla hyperventilace. Koncentrace D-dimerů a antitrombinu byly v referenčních intervalech. Dirofilaria immitis antigen snap test (SNAP® Heartworm RT Test, IDEXX Laboratories) a fekální vyšetření (flotace a technika izolace larvy Baermanna) byly negativní. Radiografie hrudníku ukázala dilataci truncus arteriae pulmonalis a pravostrannou kardiomegalii (obr. ) Echokardiografie byla silně komplikována silnou úzkostí a sípáním psa a proto byla omezena. Ukázala silnou dilataci pravé srdeční komory, mírnou uniformní dilataci hlavní plicní tepny, systolické zploštění meziprostoru mezi srdečními komorami a mírnou tricuspidální regurgitaci (obr. a). Aplikace modifikované Bernoulliho rovnice na rychlost tricuspidální regurgitační trysky ukázala odhadovaný systolický tlak plicní tepny 77 mm Hg, který byl hodnocen jako těžká PH (referenční < 25 mm, těžká > 75 mm Hg) ([]). Rozměry levé srdeční komory byly výrazně sníženy, což odpovídalo úbytku objemu levé srdeční komory. Byla provedena echokardiografie se solným kontrastním činidlem, která byla negativní, a tím bylo vyloučeno intra- a extra-kardiální pravé-levé shunting. Pro řešení těžké hypoxémie a PH byl pes umístěn do kyslíkové klece s inspirovanou koncentrací kyslíku mezi 40 a 50 %. Dále byly podávány 1,5 mg/kg/8 h perorální sildenafil (Viagra®, Pfizer, New York, USA) a 0,25 mg/kg/12 h perorální pimobendan (Vetmedin®, Boehringer Ingelheim, Německo). Tato terapie významně neovlivnila klinický stav psa. Nicméně arteriální hypoxémie se mírně zlepšila po prvním dni terapie (PaO2 se zvýšila ze 48,5 na 53 mm Hg, referenční interval 85–103 mm Hg). Echokardiogram byl opakován třetí den terapie a echokardiografické změny a závažnost PH byly výrazně sníženy. Dilatace pravé srdeční komory se dramaticky snížila, interventrikulární septum již nebylo zploštělé a gradient tlaku tricuspidální regurgitace se snížil ze 77 mm Hg na 41 mm Hg (referenční < 25 mm Hg) (obr. b). Proto byla terapie pimobendanem a sildenafilem během hospitalizace (7 dnů) dále podávána. Jako další diagnostické kroky byly 4 dny po první prezentaci provedeny (předkontrastní) počítačová tomografie (CT) s apnoí a následná chirurgická biopsie plic ve stejné anesteziologické jednotce. Byl použit jeden řezový helixový CT skener (Philips Secura, Philips NV, Eindhoven, Nizozemsko). Technické nastavení zahrnovalo 3 mm řezy, 120 kV, 200 mA, 292 mm zorného pole, 512 × 512 matice a algoritmus vysoké prostorové frekvence. Na CT obrazech plicní parenchym vykazoval jemné centrolobulární sklovité uzliny a zvětšenou plicní tepnu. Septalní linie, pleurální výpotek a lymfadenopatie chyběly (obr. a, b). CT nálezy byly kompatibilní s PH bez přesvědčivé diagnózy. Po CT vyšetření byla provedena biopsie levé laloku plic (3 × 2 cm) pro histopatologické vyšetření mini-torakotomií. Bezprostředně po tomto postupu byla jako poslední možnost zahájena léčba dexamethasonem (0,25 mg/kg q24 h i.v., Rapidexon ®, Eurovet Animal Health, Bladel, Nizozemsko), zatímco histopatologické výsledky byly v jednání (3 dny). Histopatologie chirurgické plicní biopsie ukázala středně závažnou chronickou intersticiální histiocytární pneumonii neznámé etiologie a atelektázu pomocí hematoxylinu a eosinu, periodického kyselého-Schiffova a Van Giesonova barvení. Vaskulární změny nebyly zpočátku jasně identifikovány. Vzhledem k špatné odpovědi na zahájenou léčbu a podezření na špatnou prognózu na základě histopatologických výsledků byl pes euthanizován. Pitva byla provedena s informovaným souhlasem majitele. Hrubá patologie plic ukázala středně zkolabované pevné plíce s difúzním skvrnitým vzhledem s více tmavě červenými ložisky o velikosti 1 × 1 × 3 mm a malým počtem bílých ložisek o velikosti 1 × 1 × 1 mm, často obklopených tmavě červenou zónou (demarkace) náhodně rozprostřenou po všech plicních lalocích (obr. ). Rutinní histopatologie plic ukázala multifokální cévní remodelaci. Aby bylo možné rozlišit mezi malými arteriemi a žilami, což je nezbytné pro diagnostiku PVOD, byl přidán další nátěr vizualizující elastická vlákna a kolagen (Weigertova resorcinová fuchsinová) k identifikaci elastických lamel. U tohoto psa, stejně jako u lidí s PVOD, byly postiženy všechny tři oddíly (artérie, žíly a kapiláry) plicního mikroobvodu, ačkoli změny v plicním žilním systému byly nejzřetelnější. Venulární léze zahrnovaly těžké koncentrické intimální proliferace, částečné až úplné zničení lumenu (obr., ) a posttrombotickou rekanalizaci (obr. c). Kapilární léze byly organizovány do ložisek, nejzřetelnější byla ložiska přiléhající k remodelovaným venulám a byly charakterizovány proliferací plumbových endoteliálních buněk (podobně jako u PCH) (obr., b, d). Segmentální přetížení alveolárních kapilár bylo také pravidelně spojeno s ložisky PCH (obr. ). Cévní léze se podobaly lézím PAH s koncentrickým zesílením intimy zvýšenou extracelulární matrix a mediální hypertrofií, ale komplexní plexiformní léze chyběly (obr. ). Tato zjištění byla v souladu se zjištěními popsanými Williamsem a kol. [] a odpovídala lidskému ekvivalentu PVOD. Genomická DNA případu byla izolována z EDTA krve pomocí poloautomatizovaného extrakčního robotu Chemagen (PerkinElmer Chemagen Technologie GmbH) a byla uložena při teplotě − 20 °C. Přibližně o 6 let později byla genomická DNA případu a nepříbuzná zdravá GSD analyzována pomocí sekvenování celého genomu. Integrita DNA byla zkontrolována na Bioanalyzeru (Agilent, Santa Clara, USA) a kvantifikována pomocí Qubit dsDNA HS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA). Knihovny DNA byly připraveny pomocí přípravného kitu TruSeq Nano (TruSeq Nano library prep kit, Illumina, San Diego CA, USA) s použitím 200 ng vstupní gDNA. Informace o sekvenování celého genomu při pokrytí 30× byly získány pomocí přístroje HiSeqX Ten (HiSeqX Ten instrument, Illumina, San Diego CA, USA) a 2 × 150 párů bází párových konců. Data byla zpracována pomocí našeho interního nástroje v1.2.1 () včetně analýzy somatických mutací (Strelka, VarScan, FreeBayes a MuTect) a nástroje pro analýzu genomu (GATK v. 3.2.2) [] podle pokynů pro osvědčené postupy []. Čtení sekvencí bylo mapováno proti referenčnímu genomu psů (CanFam 3.1) pomocí Burrows-Wheelerovy metody s maximálním počtem přesných shod (BWA-MEM) v0.7.5a [] následované označenými duplikáty, sloučením pruhů a přeskupením indelů. Opětovné kalibrování bází nebylo provedeno. U lidí byly mutace v BMPR2, ACVRL1, ENG, KCNK3, CAV-1 a SMAD9 považovány za příčinu autosomálně dominantní formy PAH []. Tyto geny byly zahrnuty do analýz, aby se předešlo chybějícím kandidátským mutacím způsobeným nesprávnou klasifikací fenotypů. Při porovnání případů a kontrol odhalila analýza těchto genů 196 jedinečných intronových variant. Při porovnání sekvence EIF2AK4 v případě a zdravé GSD bylo odhaleno 124 jedinečných variant, z nichž 9 bylo lokalizováno v 3'UTR, 112 bylo intronových a 3 byly exonové varianty. Případ byl homozygotní mutant pro c.2961T>C a c.1266G>A, heterozygotní variace byla nalezena u c.2092G>A. Validace variant byla provedena pomocí Sangerova sekvenování na amplifikovaných produktech polymerázového řetězového reakce z genomické DNA pomocí Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). Po ošetření exonukleázou I byly provedeny reakce sekvencí DNA pomocí BigDye v3.1, sekvenovány na ABI3130XL a analyzovány v Lasergene (verze 12.0 DNASTAR). Čtyři z pěti dalších GSD, které nebyly známy pro žádnou formu respiračního stresu a byly ve věku ≥ 10 let, odhalily identický genotyp jako případ a proto byly vyloučeny jako kauzální varianty pro PVOD.