4letá samice eurasijské vydry narozená v roce 2015 v „Sendaviva, Natural Park of Navarra“ (42°11′31″N, 1°34′33”W) (severovýchodní Španělsko) byla v roce 2017 přemístěna do volně žijícího parku „Terra Natura“ (jihozápadní Španělsko). Volně žijící park „Terra Natura“ se nachází v příměstské oblasti města Murcia (38°00′40″N, 1°09′54”W). Klec vydry se skládala z prostoru s volně přístupnými přístřešky a rybníkem s 4 zvířaty tohoto druhu (2 samci a 2 samice). Vydry nebyly ošetřeny proti písečným mouchám. V srpnu 2019 vykazovalo zvíře bilaterální epistaxi, anorexii, apatii a úbytek hmotnosti (obrázek). Zvíře bylo před manipulací sedováno medetomidinem (0,2 mg/kg/i.m.) a ketaminem (20 mg/kg/i.m.). Celá krev byla odebrána venipunkcí z hlavové žíly, vyčerpaná do 1 ml zkumavky potažené kyselinou ethylenediaminetetraacetickou (EDTA) a 1 ml zkumavky bez antikoagulantu pro kompletní krevní obraz (CBC) a biochemické analýzy. Kompletní krevní obraz byl proveden v krevním analyzátoru (ADVIA 120 Hematology System, Siemens, Itálie) a biochemické analýzy byly provedeny v automatizovaném biochemickém analyzátoru (Olympus AU600 Automatic Chemistry Analyzer, Olympus Europe GmbH, Hamburg, Německo). Kromě toho byl proveden odběr moči pro analýzu pomocí ultrazvukem naváděné cystocentesy. Byla provedena echografická studie srdce a břišních orgánů včetně ledvin, sleziny, jater, žlučníku, slinivky břišní a trávicího systému. Vzhledem k tomu, že biochemické a echografické výsledky byly v souladu s klinickou leishmaniózou, byly provedeny sérologické a molekulární testy k potvrzení přítomnosti infekce. Přítomnost protilátek IgG2 proti Leishmania byla hodnocena v séru vydry pomocí časově rozlišeného imunofluorometrického testu (TR-IFMA) provedeného podle Cantos-Barreda et al. []. Aby bylo možné otestovat, že TR-IFMA test validovaný pro psí sérum lze použít i na séru vydry, byl proveden Western blot. Western blot byl proveden v séru vydry s příznaky kompatibilními s leishmaniózou a v séru psa pozitivního na Leishmania pomocí TR-IFMA. Séra (1:2000 ředění) byla separována za redukčních podmínek na mini polyakrylamidových gelů (0,1% natrium dodecyl sulfát (SDS), 12% rozlišovací gel a 4% stahovací gel). Rozlišené proteiny byly elektroforeticky přeneseny na nitrocellulosový list (Bio-Rad, USA) a umístěny do substrátu ROTI®Lumin (Carl Roth, Německo) k blokování po dobu 2 hodin při pokojové teplotě. Ovčí polyklonální protilátka anti-psí IgG2 (AHP498; Bio-Rad, USA) byla použita jako primární protilátka v ředění 1:1000, zatímco králičí protilátka proti ovčím IgG, konjugována s peroxidázou (HRP) (SAB3700702; Sigma-Aldrich, USA) byla použita jako sekundární protilátka k detekci navázané primární protilátky. Detekce signálu byla provedena pomocí kitu Pierce ECL2 (Pierce, Thermo Fisher Scientific, USA) a byla digitalizována v skeneru Typhoon 9410 (GE Healthcare, USA). Byla pozorována přibližně 150 kDa banda jak v vzorku vydry, tak v vzorku psa (viz obrázek a příloha). Tato zjištění potvrdila, že TR-IFMA test používající protilátky proti psím IgG2 byl schopen detekovat IgG2 vydry. TR-IFMA test sestával z nekonkurenční nepřímé metody založené na biotinylovaném rekombinantním antigenu K39 jako záchytném činidle a na protilátce anti-psí IgG2 (Sheep anti-Dog IgG2, Bio-Rad, USA) Eu3 +-značené jako detektor. Test zahrnoval sérum z nemocného psa pozitivního na Leishmania jako pozitivní kontrolu a sérum ze zdravého psa negativního na Leishmania jako negativní kontrolu. Analýza byla provedena v multiznačkovém počítači (VICTOR2 1420, PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Turku, Finsko). Výsledky byly vyjádřeny jako jednotky fluorometrie pro Leishmania (UFL). Hranice byla stanovena na 22 UFL. Byl také proveden enzymatický imunoabsorpční test (ELISA) (Leiscan® Leishmania ELISA Test, Esteve Veterinaria, Laboratorios Dr. Esteve SA, Barcelona, Španělsko) detekující specifické IgG protilátky proti Leishmania spp. podle pokynů výrobce. Vzorky séra byly ředěny 1:20 a výsledky byly vyjádřeny jako poměr vzorku k pozitivnímu (S/P), který byl vypočítán podle optické hustoty (OD) vzorku/OD nízké pozitivní kontroly. Hodnoty S/P poměru vyšší než 1,1 byly považovány za pozitivní. Přítomnost DNA Leishmania spp. v plné krvi a kostní dřeni byla vyhodnocena amplifikací kinetoplastické DNA sekvence Leishmania spp. pomocí rtPCR s primery a sondami, které byly popsány dříve []. Kostní dřeň byla odebrána pomocí tenké jehly z kostokostrční křižovatky a vyčerpaná do 1 ml zkumavky potažené EDTA. DNA byla extrahována pomocí kitu pro přípravu PCR templátů High Pure (Roche, Německo) podle pokynů výrobce. RtPCR byla provedena v systému QuantStudio 5 Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Byl zahrnut vnitřní kontrolní reagent TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents (VIC Probe) (Exo IPC) (Applied Biosystems, CA, USA). RtPCR byla provedena v konečném objemu 20 μl, včetně 1× iTaq Universal Probes Supermix (Bio-Rad, CA, USA), 900 nM každého primeru, 200 nM sondy TaqMan, 1× Exo IPC Mix, 1× Exo IPC DNA a 50 ng DNA z každého vzorku. Cyklovací parametry byly: 50 °C po dobu 30 s, 95 °C po dobu 10 min, 45 cyklů při 94 °C po dobu 30 s a 55 °C po dobu 1 min. Každý cyklus amplifikace zahrnoval pozitivní a negativní kontroly a každé měření bylo provedeno třikrát. Pro identifikaci druhu Leishmania byly produkty PCR z pozitivních vzorků vyčištěny pomocí kitu pro přípravu PCR templátů High Pure (Roche, Německo) a poslány na sekvenování na Oddělení molekulární biologie, University of Murcia. Získané sekvence byly porovnány se sekvencemi dostupnými v GenBanku. Kromě toho byly jako negativní kontrola provedeny stejné analýzy na 3leté samici eurasijské vydry ze stejného parku divoké zvěře bez klinických příznaků slučitelných s leishmaniózou. Všechny výsledky se objevily v tabulce. Výskyt leishmaniózy byl potvrzen a bylo podáno specifické ošetření (allopurinol 15 mg/kg/24 h/p.o.). V listopadu 2019, po 3 měsících léčby, bylo provedeno sledování léčby. Byly pozorovány bilaterální nefropatie s hydronefrózou, mesenterická lymfadenomegalie a ascites. Krevní obraz odhalil pokles bílých krvinek a pokles krevních destiček u vydry pozitivní na leishmanie. Biochemický profil séra vydry pozitivní na leishmanie ukázal hyperproteinémii, hyperglobulinémii, pokles PON-1 a zvýšení haptoglobinu a ferritinu. Analýza moči odhalila proteinurii a pokles osmolarity a specifické hmotnosti. U vydry pozitivní na leishmanie bylo zjištěno přítomnost protilátek IgG2 proti leishmanie a pozitivní výsledek rtPCR v plné krvi a kostní dřeni. Sekvenování pozitivních vzorků potvrdilo identifikaci L. infantum. Amplifikovaná sekvence vykazovala 100% podobnost s referenční sekvencí L. infantum. Kromě toho byly v cytologii sleziny pozorovány oválné mikroorganismy s excentrickým jádrem kompatibilním s amastigoty Leishmania spp. (obrázek).