52letá žena s anamnézou cholecystektomie a částečné resekce levé hepatické laloku v roce 2004 z důvodu symptomatického žlučového kamene a vícečetné intrahepatální žlučové cesty, měla intermitentní horečku a progresivní žloutenku od začátku listopadu 2014. Obstrukce žlučových cest a podezření na hepatickou hilární malignitu byly zjištěny následnou ultrasonografií, magnetickou rezonanci cholangiopankreatografií (MRCP), zobrazováním pomocí magnetické rezonance (MRI) a pozitronovou emisní tomografií-počítačovou tomografií (PET-CT) (obr. ). Na konci listopadu 2014 byla provedena explorativní laparotomie (Další soubor: Obrázek S1) a bylo zjištěno závažné intraabdominální adheze, bulka (1 × 2 cm) s indurovanou texturou v proximálním levém hepatickém kanálu a diseminované neoplastické léze infiltrující se do hilum společného hepatického kanálu, hepatoduodenálního ligamentu, okolních lymfatických uzlin, hepatické arterie, portální žíly a celiakálního osy. Tato zjištění donutila chirurgy, aby se vzdali radikální resekce. Z žlučového kanálu byl vypuštěn purulentní žluč a ze stěny žlučového kanálu vyčníval hlenový zákal. Částečné neoplastické léze byly odstraněny ze zvětšených lymfatických uzlin, z pupíku levého hepatického kanálu a z okraje společné hepatické arterie pro patologické vyšetření. Drenáž žlučového kanálu byla zavedena pro úlevu od biliární obstrukce. Patologické zprávy odhalily, že povaha nádoru byla špatně diferencovaný adenokarcinom s diferenciálními markery cholangocytů; navíc byla zjištěna střední exprese EGFR u >90 % nádorových buněk. Tato pacientka byla nakonec diagnostikována jako pokročilá, neoperovatelná perihilární CCA. Pět týdnů po paliativní operaci pacientka dostala 4-týdenní cyklus TOMO terapie na lézi v hilarním laloku (DT = 60 Gy/25 F), jeden cyklus systematické chemoterapie s albuminem vázaným paklitaxelem samotným pro její nesnesitelné gastrointestinální toxicity a infuze autologních cytokinem indukovaných zabíjecích buněk. Vzhledem k progresivnímu nárůstu CA199 byl PET-CT okamžitě znovu vyšetřen po dokončení radioterapie a ukázal novou metastatickou hypermetabolickou lézi v hepatálním kaudátovém laloku a zvětšené měkké tkáni a retroperitoneální lymfomu s abnormální standardní hodnotou (SUV) mezi játry a žaludkem při srovnání s PET-CT před radioterapií (obr. ). Čtyři týdny po radioterapii byla pacientka zařazena do CART-EGFR studie. Její výkonnostní stav byl 1 podle kritérií Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG). Během přípravy CART-EGFR buněk vyvinula vysokou horečku, agresivní žloutenku a obstrukci žlučových cest, doprovázenou neustálým zvýšením CA199 (od 100,5 do 413,5 U/ml), agresivním zvýšením celkového bilirubinu, přímého bilirubinu a dalších enzymologických indexů souvisejících s obstrukcí žlučových cest a byla léčena účinnými širokospektrálními antibiotiky a endoskopickým zavedením stentu do žlučovodů v hepatálních žlučovodech. Zkoušky (identifikátor ClinicalTrials.gov NCT01869166, NCT02541370) byly schváleny Institucionální revizní radou při Všeobecné nemocnici čínské armády. Do studií nebyl zapojen žádný komerční sponzor. Zapsaní pacienti poskytli písemný informovaný souhlas v souladu s Helsinskou deklarací. Sekvence DNA cílového antigenu EGFR v jednom řetězci (scFv) byla odvozena z JQ306330.1 (číslo GenBank). Byl vytvořen a klonován do pWPT lentivirální páteře anti-EGFR scFv-CD137-CD3zeta CAR a byl ověřen sekvenováním DNA. Pseudotypovaný, klinický lentivirální vektorový supernatant byl vytvořen standardním přechodným transfekčním postupem, jak je popsán u Feng et al. ([]). Podle pokynů výrobce transfekčního činidla Lipofectamine 3000 (Invitrogen, USA) byly do buněk 293 T transfekovány plazmidy pWPT-anti-EGFR CAR, ps-PAX2 a obalový plazmid pMD2.G. Lentivirální supernatanty byly shromážděny a uloženy při teplotě −80 °C. Vektor GFP-CD137-CD3zeta byl vytvořen k ověření účinnosti transdukce pomocí průtokové cytometrie FACSCalibur (BD Biosciences). Sekvence DNA scFv cílového antigenu CD133 byla odvozena z HW350341.1 (číslo GenBank), generace, konstrukce a testování CAR133 T buněk následovaly stejný postup jako u buněk CART-EGFR (Další soubor: obrázek S2). Buňky CART byly vyrobeny z autologních mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) shromážděných v zkumavkách pro přípravu buněk (BD Biosciences, San Jose, CA) a vyčištěných z 80 až 100 ml plné krve v zařízení pro správnou výrobní praxi čínské všeobecné nemocnice PLA podle současných standardních provozních postupů. PBMC byly stimulovány 50 ng/ml anti-CD3 MoAb (Takara, Japonsko) a 500 U/ml rekombinantního lidského interleukinu-2 (Peprotech, USA) v médiu GT-T551 (Takara). Lentivirová transdukce byla provedena v médiu GT-T551 s protamin sulfátem (Sigma) po dobu 24 hodin po 2 dnech kultury T buněk. Poté byly buňky dále rozšířeny v kultivačních sáčcích (Takara) a sklizeny jako CART buňky. Bakterie, houby a endotoxin byly testovány před infuzí CART buněk. Immunofenotyp CART buněk byl analyzován průtokovou cytometrií s fluorescenčně značenými protilátkami specifickými pro zbarvení CD3, CD4, CD8, CD45RO, CD62L a CCR7. Pro kontrolní zbarvení byly použity monoklonální protilátky stejné isotypové skupiny (BD Biosciences). Výraz CAR byl odhadnut na základě GFP-CD137-CD3zeta-transdukovaných buněk ve stejné šarži pro všechny pacienty pomocí průtokové cytometrie. Získávání a analýza dat byla provedena pomocí průtokové cytometrie FACSCalibur (BD Biosciences). Cytotoxicita in vitro CART-EGFR buněk byla testována pomocí ko-kultivace s EGFR-pozitivními nádorovými buňkami v různých poměrech efektoru k cíli v 96-jamkových destičkách pomocí 4-hodinového detekčního kitu CCK-8 (DOJINDO, Japonsko). K posouzení úrovně fúzního genu CAR byl použit kvantitativní PCR v reálném čase (Q-PCR) podle dříve popsaného protokolu.13 Fragment 153 bází (základních párů), který obsahuje části řetězce CD8a a přilehlého řetězce 4-1BB (5′-GGTCCTTCTCCTGTCACTGGTT-3′ v případě předního primeru a 5′-TCTTCTTCTTCTGGAAATCGGCAG-3′ v případě zpětného primeru), byl amplifikován pomocí systému detekce sekvence ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems). Beta-aktin byl použit jako vnitřní kontrola. Byla připravena 7bodová standardní křivka, která se skládala z 100 až 108 kopií/μl plasmidové DNA obsahující gen CAR. Sérum IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-12/IL23p40, IFN-γ, TNF-α, VEGF a granzym B byly testovány pomocí imunologického testu s mikrokuličkami BD Biosciences podle pokynů výrobce. Podle kultivačního systému, který byl popsán dříve [], byly z mononukleárních buněk 80–100 ml periferní krve pacienta vygenerovány CART-EGFR buňky a uvolněny pro infuze. Z infuzovaných buněk během prvního cyklu CART-EGFR terapie bylo 99,14 % CD3+ buněk, které byly převážně složeny z podskupiny CD8+ (62,26 %), a 23,61 % bylo charakterizováno centrálním paměťovým fenotypem (CD45RO+/CD62L+/CCR7+). Kromě toho bylo 8,99 % infuzovaných buněk EGFR pozitivních. Fenotyp a transfekční účinnost infuzovaných CART-EGFR buněk v každém cyklu jsou zdokumentovány v tabulce. Buňky CART133 byly vytvořeny a kultivovány stejným postupem jako buňky CART-EGFR. Z infundovaných buněk bylo 95,2 % buněk CD3+, převážně složených z podskupiny CD8+ (71,9 %), a 41,9 % bylo z podskupiny CD45RO+/CD62L+/CCR7+. Kromě toho bylo 6,4 % infundovaných buněk pozitivních na CD133. Podrobnosti jsou uvedeny v tabulce. Vzhledem k nedávno dokončené radioterapii během 2 měsíců a nesnášenlivosti chemoterapeutických látek pacientce byly podány 4 denní po sobě následující infuze 2,2 × 106/kg CART-EGFR buněk celkem bez jakékoli předléčby a dosáhla PR při prvním hodnocení 6 týdnů poté, kdy byla hodnocena podle kritérií hodnocení odpovědi na solidní nádory verze 1.1 (RECIST 1.1) pomocí MRI a PET-CT, které ilustrovaly více než 80% zmenšení metastatických lézí v oblasti jaterního hilu a caudálního laloku a pozoruhodný pokles SUV (obr. ), spolu s rychlým poklesem CA199 z 413,5 na 123,1 U/ml (obr. ). Počet kopií CAR transgenu v periferní krvi pacientky dosáhl vrcholu 5916 pg/dl 9. den, kdy byly uvolněny cytokiny, jako interleukin-6 (IL-6) a C reaktivní protein (CRP) (obr. a). Druhý cyklus CART-EGFR monoterapie byl podán s dávkou EGFR-CAR+ exprimujících T buněk 2,1 × 106/kg a bez jakékoli předléčby, protože počet kopií CAR transgenu v periferní krvi klesl na úroveň základní linie 2 měsíce po první infuzi geneticky modifikovaných T buněk exprimujících CART-EGFR. Rutinní vyšetření MRI a PET-CT ukázala přetrvávající PR, doprovázenou dalším snížením CA199 na 61,2 U/ml (obr. a). Je zajímavé, že vrchol počtu kopií CAR transgenu po druhé infuzi CART-EGFR buněk nedosáhl úrovně paralelní nebo vyšší úrovně, jako tomu bylo u první infuze CART-EGFR terapie (obr. ). Stav PR pacientky byl udržován po dobu 8,5 měsíců, dokud se u ní neobjevily časté nekontrolovatelné zvracení, tupá bolest v horní části břicha a reflux žaludečních kyselin, které se objevily v polovině listopadu 2015. Následné elektronické gastroskopie ukázaly strikturu bulbu duodena a PET-CT potvrdilo progresi nádoru s ilustrací více nových abnormálních lézí SUV v omentumu majus, peritoneu a břišní dutině (obr. ). Pacient byl následně léčen 1 cyklem CART-EGFR terapie v kombinaci s 2 cykly anti-programované buněčné smrti protein 1 (PD-1) monoklonální protilátky (Nivolumab, Bristol-Myers Squibb), která byla podávána v dávce 100 mg každé 2 týdny. Stejně tak počet kopií CAR transgenu monitorovaných v periferní krvi nedosáhl podobné vrcholové úrovně infuze prvního cyklu ani v kombinaci s anti-PD-1 protilátkou (obr. ). Navzdory tomu, že sérový CA199 přechodně poklesl z 326,3 na 210,8 U/ml (obr. ), následující PET-CT detekovala nově vzniklé metastázy ve spodní části pánve, pravém laloku jater a levém supraklavikulárním lymfatickém uzlu, stejně jako zvětšení předchozích nádorových lézí v břiše, když byl porovnán s PET-CT před kombinovanou imunoterapií (obr. a). Protože více než 90 % nádorových buněk exprimovalo protein CD133 (Další soubor: Obrázek S3), byla pacientka zařazena do studie CART133 a dostala infuzi 1,22 × 106/kg CD133-specifických CART buněk bez přípravné léčby. Vzhledem k výskytu obstrukce v sestupném duodenu a výsledné přetrvávající těžké infekci žlučových cest a abscesu jater, které mohly ovlivnit hladinu sérového CA199 a byly léčeny antibiotiky, bylo plánované zobrazovací vyšetření odloženo až na 2 měsíce po infuzi CART133 buněk, kdy kontrastem zesílené CT ukázalo výrazné zmenšení nebo dokonce zmizení některých metastáz v peritoneu a břišní dutině, což vedlo k vyhodnocení PR (Obrázek). Počet kopií CAR transgenu v periferní krvi kolísal od 377 do 919 pg/dl (Obrázek). Pacientka po 2,5 měsících později cítila přetrvávající tupou bolest v horní části břicha a následný CT snímek odhalil přibližně 40 × 70 mm novou metastatickou lézi pod břišní stěnou a podezření na metastázy v břišní dutině doprovázené poklesem počtu kopií CAR transgenu v PB téměř na výchozí úroveň, což vedlo k závěru o progresivním onemocnění (Obrázek). Nežádoucí účinky, jako jsou zimnice, horečka, únava, zvracení a bolest svalů, které se objevily během infuze buněk CART-EGFR, byly obvykle mírné, tolerovatelné a zvládnutelné pomocí podpůrné péče. Pacient však vyvinul 9denní nižší horečku bez zimnice, kašle, průjmu nebo jiných infekčních příznaků od třetího dne po infuzi buněk CART. Opakované laboratorní vyšetření PB ukázalo normální počet bílých krvinek, poměr neutrofilů, negativní procalcitonin (PCT) a krevní kultury, které nepodporovaly diagnózu infekce, ale mezitím eskalace IL-6 a CRP (obr. ) a akutní zvýšení glutamát-pyruvát transaminázy a glutamát-oxalacetát transaminázy (>6ULN). Objevilo se několik rozptýlených drobných vyrážek na levé stehno 2 týdny po první infuzi buněk CART-EGFR, které se postupně zhoršily a staly se zjevnými a svědivými s výskytem více šupinatých nebo lineárních vyrážek šířících se z levého stehna do lýtka a splývajících dohromady, což bylo hodnoceno jako stupeň 2 podle společné terminologické klasifikace nežádoucích účinků 4.0 (CTCAE 4.0), když byl splněn druhý cyklus CART imunoterapie. Vyrážky byly podrobeny biopsii s ilustrací patologických změn lichen striatus, jako je ztráta části epidermis, vakuolární degenerace bazálních buněk a infiltrace četných T lymfocytů v epidermis a jejích přídatných částech (obr. ), a byly úspěšně zvládnuty mastí s takrolimem. Během léčby CART-EGFR nedošlo k hypotenzi. Kromě mírné nevolnosti, zvracení, zimnice, horečky a únavy se v průběhu kombinované léčby nevyskytly žádné další akutní nežádoucí účinky. I když se po kombinované imunoterapii objevily lupy a zhoršily se, nevyžadovaly lékařské zákroky. Hladiny cytokinů v séru, jako je například faktor nádorové nekrózy alfa (TNF-α), IL-6 a CRP, se mírně zvýšily a nevyvolaly žádné příznaky uvolňování cytokinů. Během infuze postupného zvyšování dávky CART133 buněk během 4 dnů se nevyskytly žádné jiné nežádoucí účinky kromě mírné horečky a únavy spojené s infuzí. Nicméně druhý den ráno po dokončení infuze CART133 buněk se u této pacientky objevily intermitentní bolesti v horní části břicha, zimnice, horečka (39,1 °C), sporadické bodové krvácení a kongestivní vyrážky na lýtkách, které se rychle a difuzně rozšířily na krk, pravou horní část paže, hrudník, levé břicho a retrofaryngeální sliznici, doprovázené svěděním a průjmem, který se objevil odpoledne a během následujících 10 dnů se dále zhoršoval (obr. ). Kožní a podkožní nežádoucí účinky byly hodnoceny stupněm 3 podle CTCAE 4.0. Sériové vyšetření cytokinů v séru odhalilo rychlý nárůst TNF-α, IL-6 a CRP (obr. ). Etanercept, fúzní protein, který působí jako inhibitor TNF, intravenózní methylprednisolon a gama globulin byly okamžitě podány a úspěšně zvrátily kožní/slizniční toxicity. Používání CAR-modifikovaných T buněk k vymýcení nádorů bylo studováno více než 20 let až do nedávna, kdy CART19 přinesla slibné výsledky u CD19 exprimujících hematologických malignit. Jak však tento vzrušující úspěch CART terapie přenést na solidní nádory, zůstávalo nejasné a vyžadovalo lepší pochopení potenciálních terapeutických bariér včetně faktorů, které regulují expanzi CART buněk, jejich perzistenci a pohyb in vivo, nádorového mikroprostředí a jeho interakce s nádorovými buňkami a nádorovými kmenovými buňkami, stejně jako přípravné terapie. Jak Porter a kol. poukázali na to, že intenzivní expanze a přetrvávání CART buněk in vivo je kritickým faktorem terapeutické účinnosti [], v tomto případě počet kopií CAR transgenu v PB dosáhl vrcholu bezprostředně po začátku infuze CART-EGFR buněk, což ilustruje, že CART-EGFR buňky prošly robustní expanzí in vivo, což je jeden z předpokladů toho, že CART-EGFR buňky eliminují CCA buňky exprimující EGFR. Kromě toho bylo navrženo, že přetrvávání CART buněk in vivo, navzdory řadě možných interferenčních faktorů, jako je afinita CAR k cíli, imunogenicita CAR a faktory odvozené z hostitele, je přímo korelováno s delším časem do progrese []. Tento pacient byl léčen druhou infuzí CART-EGFR buněk, jakmile počet kopií CAR transgenu v PB klesl těsně k základní úrovni 8 týdnů po první infuzi, což umožnilo, aby CART buňky účinně přetrvávaly in vivo po dobu více než 24 týdnů a stav PR pacienta byl udržován po dobu 8,5 měsíce, což může naznačovat, že opakované infuze CART buněk mohou přispět k prodloužení jejich přetrvávání in vivo a zajištění delší doby přežití bez progrese v podmínkách, kdy cílový nádor reagoval na CART-EGFR buňky. Mezitím jsme také zjistili, že počet kopií CAR transgenu v následujících cyklech infuze CART buněk nemohl dosáhnout paralelního nebo vyššího vrcholu, dokonce ani v kombinaci s protilátkou anti-PD-1, ve srovnání s prvním cyklem, což naznačuje oslabení expanze CART buněk in vivo a ztrátu CART buněk. Jedním z možných mechanismů je, že myší scFv začleněný do CAR transgenu může vést k rozvoji imunity CD8+ T buněk []. Konečně funkční způsobilost CART buněk v solidních nádorech je určována tím, zda mohou účinně proniknout do mikroprostředí nádoru, což je komplexní a hustá síť fibrotických matric, které jsou orchestrovány jak maligními, tak i nemaligními buňkami, v nichž mohou být infiltrované CART buňky inhibovány imunosupresivními buňkami a molekulami, jako jsou Treg, myeloidní supresivní buňky (MDSC) a ligand programované buněčné smrti 1 (PD-L1) [,], což vede k rychlé ztrátě jejich schopnosti cytolýzy a sekrece cytokinů a k nástupu hyporesponsivity []. Kromě toho vykazují solidní nádory často metabolické abnormality, kdy nadměrně spotřebovávají klíčové aminokyseliny, které jsou důležité pro aktivitu T buněk, a způsobují hypoxii a následnou acidifikaci extracelulární matrice v důsledku nedostatečné vaskulární sítě, která je pro přežití T buněk nepříznivá []. Proto je k zlepšení výsledků nutné upravit mikroprostředí nádoru. V tomto případě, i když pacientka nedostala žádnou přímou přípravnou léčbu s cílem transformovat mikroprostředí nádoru, byla před imunoterapií léčena radioterapií v dávce 60 Gy s odstupem přibližně jednoho měsíce od konce radioterapie do začátku infuze CART buněk. Ačkoli samotná radioterapie nedokázala účinně vymýtit nádorové buňky, její přímý a opožděný účinek může hrát roli při ničení stroma podporujícího nádor, změně biologické povahy mikroprostředí nádoru, podpoře uvolňování více nádorových antigenů a posílení imunitního rozpoznávání []. Navíc může radioterapie učinit nádory imunogennějšími a náchylnějšími k lepšímu útoku imunitních buněk [], a dokonce může vyvolat protinádorové účinky v těch vzdálených metastázách, které nebyly lokálně ozářeny (označované jako abskopální účinek) [, ]. Proto předkládáme hypotézu, že radioterapie může být rozumnou a účinnou přípravnou léčbou ke zlepšení výsledků CART terapie. Když byl odpor k CART-EGFR terapii potvrzen, jednou jsme vyzkoušeli kombinaci imunoterapie anti-PD-1 protilátkou ve spojení s infuzí CART-EGFR buněk na základě preklinické studie, že blokáda PD-1 imunosuprese může významně zvýšit terapeutickou účinnost CART buněčné terapie proti zavedeným solidním nádorům []. Bohužel tato léčba skončila neúspěchem, kdy PET-CT potvrdilo progresi onemocnění, ačkoliv CA199 byl přechodně snížen. Jedním z možných vysvětlení je nejasná úroveň exprese PD-L1. V poslední době je exprese PD-L1 zdůrazňována pro svou hodnotu při předpovídání terapeutických účinků anti-PD-1 léků. Nicméně nádorová léze byla v tomto případě pro svou anatomickou polohu obtížná pro biopsii, což mělo za následek, že úroveň exprese proteinu PD-L1 na nádorových buňkách nemohla být přesně detekována před zahájením anti-PD-1 terapie, což je možnost, že exprese PD-L1 v nádorovém prostředí může být na nízké úrovni nebo dokonce negativní, a proto může vést k selhání anti-PD-1 léčby. Mezitím bylo mnoho jiných paralelních kontrolních drah, které mohly potenciálně podpořit rezistenci k anti-PD-1 terapii [] Za této situace bylo důležité vybrat racionální cíl pro další krok léčby pacientů. Nedávno přitahovaly CSC v CCA velkou pozornost pro své vysoce karcinogenní vlastnosti a klíčové role při zprostředkování sebeobnovy, opětovného růstu nádoru a terapeutické rezistence, v důsledku toho je terapie, která se zaměřila na povrchové molekulární markery a signální dráhy specifické pro CSC, potenciální silnou možností pro CCA [,] Mezi molekulami používanými jednotlivě nebo v kombinaci k identifikaci cholangiocarcinomových kmenových buněk je CD133 jedním z nejdůležitějších kmenových buněčných markerů, které jsou spojeny s vyšší invazivitou a horší prognózou [] Shien a kolegové také uvedli, že CD133-pozitivní nádorové buňky vykazovaly větší rezistenci k pooperační léčbě než CD133 negativní buňky a zvýšená exprese CD133 byla pozorována v reziduálních nádorových buňkách po adjuvantní léčbě [] Na základě výše uvedeného jsme nakonec vybrali CD133 jako cílový antigen pro CART imunoterapii, která následně vyústila v další částečnou odpověď a dále prokázala, že CART koktejlová imunoterapie může být proveditelná a racionální. Dalším zásadním problémem byla toxicita, kterou mohly CART buňky vyvolat na cílových antigenech exprimovaných na nádorových buňkách a/nebo synchronně na normálních tkáních, označovaná jako „on-target off-tumor effect“. Poškození normálních tkání mohlo dokonce nastat v důsledku neočekávané zkřížené reakce s bílkovinou, která není exprimována na nádorových buňkách. Od zahájení infuze CART-EGFR buněk tento pacient zažil nejen horečku, zimnici a únavu související s infuzí, ale také přetrvávající pyrexii, akutní zvýšení sérových transamináz a opožděný nástup kožních vyrážek, doprovázený výrazným zvýšením počtu kopií CAR transgenu, IL-6 a CRP, ačkoli jejich hladiny nesplňovaly kritéria pro diagnózu syndromu uvolňování cytokinů. [] Masivní cytokiny, které mohly být přímo produkovány infuzí CART buněk, odrážely silnou imunitní odpověď, která mohla generovat jak protinádorové účinky na nádorové buňky, tak vedlejší účinky na normální tkáně. Kromě toho, on-target off-tumor efekt způsobený CART-EGFR buňkami byl pravděpodobně důvodem pro vyvolání dermální toxicity v důsledku distribuce EGFR na epidermis. [] Nicméně, všechny tyto nežádoucí účinky byly mírné, reverzibilní a zvládnutelné pomocí podpůrné péče a topického kortikosteroidu. Přidání anti-PD-1 protilátky zřejmě nezhoršilo toxicitu CART-EGFR imunoterapie v tomto případě. Nicméně, při následném ošetření infuzí CART133 buněk tento pacient utrpěl závažné dermatologické, ústní slizniční a gastrointestinální toxicity, jako je kongestivní vyrážka a krvácení. Ačkoli byly tyto toxicity úspěšně zvládnuty pomocí nouzových lékařských zákroků včetně intravenózní methylprednisolony a inhibitoru anti-TNF, jejich vlastní mechanismus může být z velké části způsoben on-target off-tumor efektem CART133 buněk, které se zaměřily na antigen CD133 exprimovaný na normálním epitelu a vaskulárním endotelu. Mezitím nebylo jasné, zda by mohly anti-PD-1 protilátky a zbytkové CART-EGFR buňky in vivo hrát roli při zhoršování toxicity CART133 imunoterapie.