Toto téma představoval 22letý muž s B-ALL, který měl před zařazením do našeho soucitného klinického protokolu s použitím buněk TanCAR-T 19 třetí recidivu kostní dřeně (BM) s počtem WBC vyšším než 100 × 109/l a normálním karyotypem v lednu 2016. Po úplné remisi (CR) 2 podstoupil haplo-HSCT od svého otce 10 měsíců po původní diagnóze. Trpěl hemoragickou cystitidou a akutní GVHD 1. stupně v rámci 2 měsíců po haplo-HSCT, která se vyřešila 15 denními dávkami methylprednisolonu 50 mg následovanými 5 denními dávkami methylprednisolonu 100 mg. Tři měsíce po vysazení cyklosporinu A a methylprednisolonu došlo k relapsu jeho nemoci s 6,4 % blastů v kostní dřeni, když ještě měl plný dárcovský chimerismus, poté rychle postupovala s 56,5 % blastů v kostní dřeni měřených průtokovou cytometrií 10,6 měsíců po haplo-HSCT a nezjistitelným dárcovským chimerismem. Dostal záchrannou chemoterapii s MOEP (3 denní dávky mitoxantronu 10 mg, vindesinu 4 mg, 3 denní dávky etoposidu 100 mg a 5 denních dávek dexamethasonu 15 mg) a měl těžkou depresi kostní dřeně a žádnou odpověď s 65,4 % blastů v kostní dřeni 1 měsíc po prvním cyklu MOEP. Poté byl léčen protokolem s haplo-CAR-T 19 buňkami. Dostal chemoterapii s redukcí buněk vindesinem a methylprednisolonu plus hydroxyureou a lymfodeplecí s daunorubicinem a cyklofosfamidem a jeho blastů v kostní dřeni klesl na 12,7 % před infuzí haplo-CAR-T 19 buněk. Haplo-CAR-T 19 buněk v dávce 4,91 × 106/kg (2,89 × 107 T buněk/kg, 17 % účinnosti transfekce) byl podán a indukoval MRD-negativní CR (MRD-CR) a plný dárcovský chimerismus do 2 týdnů po infuzi. Podané haplo-CAR-T 19 buňky vykazovaly rychlou expanzi a dosáhly vrcholu 15 281 kopií na mikrogram DNA během prvních 2 dnů po infuzi, ale klesly z 3374 kopií na mikrogram DNA 7. den na 468 kopií na mikrogram DNA 12. den; methylprednisolon 160 mg a dexamethason 5 mg byl použit 11. den k léčbě syndromu uvolňování cytokinu stupně 3 (CRS). Zažil akutní GVHD 3. stupně během 1 měsíce po infuzi buněk haplo-CAR-T 19, který byl pod kontrolou 5 denních dávek methylprednisolonu 40 mg plus cyklosporinu A 80 mg podávaných od 31. dne po infuzi buněk haplo-CAR-T 19. Nicméně 1 měsíc po získání MRD-CR, jeho nemoc vykazovala floridní progresi s počtem WBC 1,59 × 109 až 12,52 × 109/l a odpovídajícím procentem cirkulujících blastů 1,39 až 67,37 % během 2 týdnů; jeho kostní dřeň vykazovala vysoce aktivní buněčnou proliferaci s 59,67 % blastů, které měly expresní vzorec CD19+ CD34+ CD10+ CD22+ CD38+ CD58+ CD33- CD13- CD15-. Současně byly zaznamenány nezjistitelné haplo-CAR-T 19 buňky a dárcovský chimerismus. V tomto případě mohly být pro tohoto pacienta potenciální možností léčby jiné terapie včetně buněk TanCAR-T 19/22 namísto záchranné chemoterapie nebo reinfúze buněk CAR-T 19 namísto záchranné chemoterapie, a to vzhledem k špatné odpovědi na záchrannou chemoterapii a špatné perzistenci infundovaných buněk CAR-T 19. Vyšší nádorová zátěž a krátký časový interval po vysazení steroidů však výrazně zvýšily riziko selhání tvorby autologních buněk CAR-T; prudký rozvoj onemocnění způsobil, že čekání na vysazení steroidů bylo méně proveditelné. Terapie buněk TanCAR-T 19/22 odvozených od dárce byla optimálním přístupem k překonání tohoto problému, ale jak je známo, terapie haplo-buněk CAR-T se nedoporučuje rutinně v případě předchozí GVHD vyžadující steroidní léčbu, a to především kvůli zvýšenému riziku reaktivace GVHD. Po pečlivém zvážení klinických přínosů a rizik druhé infuze buněk haplo-CAR-T byl zařazen do našeho soucitného klinického protokolu s použitím buněk haplo-TanCAR-T 19/22. Jeho otec podstoupil aferézu a periferní krevní mononukleární buňky (PBMC) byly použity k přípravě buněk TanCAR-T 19/22. Dostal cytoredukční chemoterapii s vindesinem 4 mg a pěti denními dávkami methylprednisolonu 80 mg a třemi denními dávkami hydroxyurey 3 g, po nichž následovala lymfodepleční chemoterapie s idarubicinem v celkové dávce 30 mg a cyklofosfamidem v celkové dávce 3 g. Plánovaná aspirace kostní dřeně po výše uvedené chemoterapii a před infúzí buněk haplo-TanCAR-T 19/22 nebyla provedena kvůli špatné spolupráci pacienta. O dva dny později byl léčen buňkami haplo-TanCAR-T 19/22 v celkové dávce 4,72 × 106 buněk TanCAR-T 19/22 na kilogram (3,05 × 107 buněk T na kilogram, 15% transfekční účinnost) podávané ve frakcionovaných dávkách (D0, 30%; D1, 70%), z důvodu zvážení bezpečnosti (obr. a). Materiály a metody použité při výrobě TanCAR-T 19/22 byly popsány dříve [–], s výjimkou konstrukce CAR a zdroje PBMC použitých při výrobě buněk TanCAR-T 19/22. TanCAR-19/22 byla tandemová molekula CAR, sestávající z anti-CD22 scFv odvozeného z myšího mAb m971 [] a anti-CD19 scFv odvozeného z myšího mAb FMC63 [], spojených v tandemu, lidského CD8α závěsu a transmembránového domény a lidských signálních domén CD137 a CD3ζ. Schematický nákres TanCAR-19/22 je znázorněn na obr. a. PBMC použité při výrobě buněk TanCAR-T 19/22 byly shromážděny leukaferézou spíše než čerstvou periferní krví (PB). Pro stanovení účinnosti transfekce TanCAR-19/22 a kvantifikace haplo-TanCAR-T 19/22 buněk v klinických vzorcích byla použita průtoková cytometrie s použitím protilátky Biotin-SP-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG, F (ab') 2 Fragment Specific (Jackson ImmunoResearch, USA) a protilátky PE Streptavidin (BD Biosciences, USA). Haplo-TanCAR-T 19/22 buňky v klinických vzorcích byly také měřeny qPCR, jak je popsáno []. Rozsah dárcovského štěpu v klinických vzorcích byl posouzen pomocí amplifikace krátkých tandemových opakování a vícenásobné PCR s fluorescenčním značením v kombinaci s kapilární elektroforézou, jak je popsáno []. Sérum interleukin (IL)-2, IL-6, IL-8 a IL-10 a hladiny faktoru nádorové nekrózy alfa byly analyzovány v dávkách, jak je popsáno []. Před protokolem haplo-TanCAR-T 19/22 vykazoval krevní obraz převážně blastové buňky s absencí normálních prekurzorů BM. Průtoková cytometrie BM 14. den po infuzi haplo-TanCAR-T 19/22 buněk ukázala, že zbývající blastové buňky v BM byly 0,73 %. Je třeba poznamenat, že tyto zbytkové leukemické blastové buňky vykazovaly vzorek exprese CD34+ CD10+ CD22+ CD38+ CD33+ CD19− CD20−, který nebyl průtokovou cytometrií detekován 28. den v případě absence další léčby (obr. a). Vzhledem k neúplnému zotavení počtu krevních destiček a absolutního počtu neutrofilů 28. den pacient dosáhl MRD-CRi 28. den po infuzi. V BM nebyl žádný důkaz blastů ani pomocí nátěru BM ani průtokovou cytometrií v následných časových bodech po dobu 14 měsíců (obr. b a Doplňkový soubor: Obrázek S1). BM vykazovalo obnovení normální hematopoézy 56. den s výjimkou počtu krevních destiček, který se stále nezotavil na úroveň 36 × 109/l v době této zprávy. Celkový dárcovský chimérismus byl stanoven 14. den po infuzi a poté zůstal stabilní. Po infuzi se buňky haplo-TanCAR-T 19/22 rozšířily a dosáhly vrcholu na úrovni 30,7 % cirkulujících T buněk ve 12. den, následované kontrakční fází s nízkou úrovní 0,45 % cirkulujících T buněk ve 28. den. To se shodovalo s eliminací cirkulujících B buněk, které byly ve 28. den téměř nezjistitelné průtokovou cytometrií. Buňky haplo-TanCAR-T 19/22 byly stále měřitelné s nízkou úrovní 2,29 % cirkulujících T buněk a cirkulující B buňky se ještě nezotavily v době této zprávy (obr. c a Doplňkový soubor: Obrázek S2). Buňky haplo-TanCAR-T 19/22 byly přítomné také průtokovou cytometrií ve všech časových bodech hodnocení odpovědi v kostní dřeni získané při hodnocení odpovědi a byla zdokumentována chronická aplázie B buněk (obr. d a Doplňkový soubor: Obrázek S2). Celkově byla zaznamenána shoda mezi rozšířením a perzistencí buněk haplo-TanCAR-T 19/22 v PB měřenou průtokovou cytometrií a qPCR. V době této zprávy byl DNA TanCAR-19/22 stále zjistitelný na qPCR s 1134 a 396 kopiemi na mikrogram DNA v PB a BM (obr. e). Po infuzi haplo-TanCAR-T 19/22 buněk zaznamenal pacient stupeň 3 CRS podle stupnice UPenn ([]). Horečka až 38,8 °C se objevila během 24 hodin po infuzi haplo-TanCAR-T 19/22 buněk a trvala 11 dní. Horečka ustoupila 12. den po léčbě nižší dávkou tocilizumabu 160 mg (1,6 mg/kg) a etanerceptem 50 mg 8. den (obr. a). Více sérových cytokinů se výrazně zvýšilo 7 dní po infuzi a téměř se vrátilo na základní hodnoty 41. den (obr. b, c), kdy hladina interleukinu (IL)-6 dosáhla 3377 pg/mL (88krát nad základní hodnotou) 11. den. Hladina aspartát aminotransferázy a laktát dehydrogenázy se výrazně zvýšila 8 až 10 dní po infuzi, dosáhla vrcholu 1529,1 U/L (38krát nad horní hranicí normálních hodnot) a 2027,8 U/L (13krát nad základní hodnotou) 12. den a vrátila se na základní hodnoty 21. den při nejlepší podpůrné péči (obr. d, e). Pacient také vykazoval koagulační dysfunkci s prodlouženou aktivovanou parciální tromboplastinovou dobou, zvýšenými D-dimery a sníženými koncentracemi fibrinogenu, stejně jako kapilární prosakování s hypokalememií 2. stupně navzdory intenzivní suplementaci bílkovinami během CRS, která se vyřešila 23. den (obr. f–h). Předchozí akutní GVHD 3. fáze, která byla pod kontrolou, se znovu aktivovala a rychle postoupila do 4. fáze s nově vzniklými lokálními kožními ulceracemi, zejména v kůži šourku a v ústní sliznici, 11 dní po infuzi haplo-TanCAR-T 19/22 buněk (obr. a). Koncentrace celkového bilirubinu v séru se od 12. dne neustále zvyšovala a 21. dne dosáhla 134 μmol/l (obr. b). Vzhledem k rychle se rozvíjejícím projevům kožní GVHD a postižení jater byla od 21. dne podána nižší dávka methylprednisolonu 20 mg denně jako počáteční dávka s následným snižováním ve snaze vyvážit přínosy a rizika systémové imunosuprese. Kožní vyrážka a celkový bilirubin v séru se po těchto léčbách výrazně zlepšily. K projevům střevní GVHD 3. fáze, zejména včetně průjmu, došlo od 50. dne a celkový bilirubin v séru se opět zvýšil, což naznačovalo akutní GVHD 3. fáze. Šestnáct dávek methylprednisolonu 20 mg denně bylo znovu podáno od 78. dne, což výrazně omezilo průjmy a celkový bilirubin v séru. Tento pacient následně vykazoval středně závažnou chronickou GVHD, která se projevila především jako sklerodermie, průjmy a úbytek hmotnosti. Přetrvávající trombocytopenii s počtem krevních destiček v rozmezí 15 × 109 až 43 × 109/l bez transfúze krevních destiček bylo možné považovat za projev chronické GVHD v rámci obnovy normální hematopoézy. Systémová imunosupresivní léčba byla během 2 měsíců postupně snižována methylprednisolonem 4 mg každý druhý den a methotrexátem 5 mg jednou týdně a sirolimusem 1 mg denně jako minimální udržovací dávkou od 154. dne až do doby vyhotovení této zprávy (obr. b), což udržovalo chronickou GVHD pod dobrou kontrolou.