47letá žena (hmotnost: 62 kg) byla v roce 1996 diagnostikována chronická aktivní HBeAg-pozitivní hepatitida B. Virové parametry, jako HBeAg, anti-HBe IgG a HBV virová zátěž v plazmě, byly měřeny současně jedinečným operátorem, aby se snížily intra- a inter-assay variace. HBeAg a anti-HBe byly stanoveny pomocí elektrochemiluminescence (ELECSYS 2010, Roche Diagnostic). Úrovně virové zátěže HBV byly stanoveny pomocí PCR v reálném čase (COBAS TaqMan Roche Molecular Systems, dynamický rozsah 30 IU/ml až 110 000 000 IU/ml) []. Zánět jater byl měřen pomocí hladin sérové alaninaminotransferázy (ALT). Pro analýzu sekvence byly HBV pol a preC-core geny sekvenovány s pomocí primerů, jak bylo popsáno výše []. Analýza byla provedena pomocí přístroje ABI3100 (Applied Biosystems) a sekvence zavedené v této práci, stejně jako ty získané z databáze GenBank, byly zarovnány s pomocí ClustalX v1.83 [] a editovány pomocí Bioedit v7.0.9.0 [] Genotyp HBV byl posouzen pomocí fylogenetické inference s pomocí algoritmu Neighbor-joining s Kimurovým dvouparametrovým modelem molekulární evoluce v softwaru MEGA v3.1 [] Sekvence z obou genů byly získány v různých časových bodech během antivirové terapie (obrázek). Podrobnější klonová analýza HBV pol genu byla provedena na sedmi vybraných virových izolátech ze sérových vzorků odebraných během sekvenčních terapií. Každý vybraný PCR produkt pol genu byl klonován do pGEM-T Easy vektoru podle pokynů výrobce (Promega, Wisconsin, USA) a nejméně 15 klonů bylo dále analyzováno sekvenováním. To umožnilo analyzovat vývoj virových kvazispecií pod následným antivirovým tlakem na základě analýzy pol genu. Intervence proti HBV léčbou doprovázené kinetickými údaji o virové zátěži HBV a ALT jsou znázorněny na obrázku. Terapie byla zahájena, když se virová zátěž HBV zvýšila na 6,5 × 106 IU/ml. V roce 1998, kdy byl pacient léčen IFN-alfa 5 MU třikrát týdně po dobu 30 týdnů, byla hladina HBV DNA nižší než detekční limit. Tato terapie byla přerušena a v roce 1999 nahrazena lamivudinem (150 mg jednou denně). Po 2 letech nepřetržité léčby byla HBV DNA detekovatelná (15,5 × 106 IU/ml). HBeAg zůstal negativní s detekovatelnými protilátkami proti HBe během tohoto období léčby. V roce 2001, po 6měsíčním přerušení, hladina HBV DNA ukázala po léčbě vzplanutí (1 × 108 IU/ml). Na konci roku 2003 byla znovu zavedena terapie lamivudinem (150 mg jednou denně). Doprovázela ji vzácná událost reverze k profilu HBeAg pozitivní/anti-HBe negativní, který zůstal detekovatelný po dobu dvou let. V tomto okamžiku dosáhla virová zátěž 3,1 × 106 IU/ml. O deset měsíců později, v roce 2006, byl lamivudinový režim nahrazen monoterapií adefovirem (10 mg/den). Zpočátku byly hladiny virové zátěže nízké (8,5 × 104 IU/ml), ale po 48 týdnech terapie tyto hladiny dosáhly 7,15 × 106 IU/ml. Hladiny ALT byly během tohoto období normální. Reaktivace replikace HBV byla předpokládána vzhledem k současnému zjištění HBeAg/anti-HBe [] a vysoké detekované replikaci. Souběžné zjištění HBeAg a anti-HBe se nezdá být neobvyklé u pacientů, kteří dosud nebyli léčeni antivirovými přípravky, ale jeho prevalence u pacientů, kteří již byli léčeni, není známa. Tento sérologický vzorec byl spojen s rozsáhlým poškozením hepatocytů a těžkým imunitně zprostředkovaným poškozením jater a následnou dysfunkcí []. O šest měsíců později se hladina ALT mírně zvýšila (1,5 × horní hranice normálu - UNL -) a byla zavedena monoterapie entekavirem (1 mg denně). Po 5měsíční monoterapii entekavirem byl k léčebnému režimu přidán tenofovir (300 mg jednou denně) pro duální terapii. HBV DNA klesla na 1 × 105 IU/ml po dobu čtyř měsíců, ale o tři měsíce později virová zátěž dosáhla > 1,1 × 108 IU/ml. Navíc zvýšení hladiny ALT (20× UNL) naznačovalo zánět jater. Během následujících 48 týdnů se virová replikace mírně snížila na 6,1 × 106 IU/ml, ale znovu se zvýšila nejprve na 3,6 × 107 IU/ml a později na > 1,1 × 108 IU/ml. V poslední době (druhý semestr 2010) kolovaly hladiny HBV DNA mezi 4,3 × 104 IU/ml a 4,9 × 107 IU/ml. Ke konci sledování studie jsme byli schopni měřit koncentraci tenofoviru v plazmě pomocí vysoce výkonné kapalinové chromatografie ve třech po sobě následujících vzorcích 20 hodin po podání, která dosahovala 71,6 ng/ml ± 47,6 (průměr ± SD). Úrovně ALT a AST zůstaly během posledních dvou let sledování mírně zvýšené (2× UNL). HBV izoláty od pacienta byly přiřazeny k genotypu A2 na základě fylogenetické příbuznosti mezi částečnými genomickými sekvencemi HBV z obou pol a preC-C genů. Další longitudinální genotypická analýza, včetně kvaziseverity složení HBV kmenů izolovaných od pacienta, odhalila přítomnost rezistentních mutací na základě pol genových sekvencí (Tabulka). Na začátku léčby lamivudinem byl HBV divokého typu ve všech klonech. Po 2 letech pod takovou terapií byla tato virová populace zcela nahrazena mutací rtM204I - homogenně vykazující rezistenci na lamivudin. Když byla tato terapie přerušena na 6 měsíců, kvaziseverity složení téměř výhradně sestávalo z nukleotidových sekvencí divokého typu pol, s výjimkou menšího příspěvku (< 10%), vykazujícího mutaci I233V spojenou s rezistencí na adefovir. Jakmile byla znovu zavedena léčba lamivudinem, a dokud nebyla podávána entekavir plus tenofovir, byly vždy detekovány duální mutace rtL180M a rtM204I spojené s rezistencí na lamivudin. V rámci tohoto posledního terapeutického schématu byly detekovány pouze efemerní a s menším příspěvkem (~5%), mutace A181T a T184L spojené s rezistencí na lamivudin a entecavir. Kromě toho byly v době rezistence na lamivudin zjištěny další dvě varianty v katalytické doméně reverzní transkriptázy. Tyto varianty rtA200V a rtI253V zůstaly přítomné během léčby entekavirem a byly také zjištěny ve vzorcích sekvenovaných po průlomu během léčby entecavirem. Genomická charakterizace HBV na úrovni preC-C ukázala přítomnost dvojité mutace A1762T a G1764A, která byla včas zjištěna, když pacient nebyl léčen, a zůstala v tomto stavu během celého sledování. Mutace T1753C byla také důsledně zjištěna. Přítomnost těchto základních promotorových mutací souvisí také s výše zmíněným souběžným profilem HBeAg-antiHBe nalezeným u tohoto pacienta, jak bylo nedávno hlášeno [].