73letý pacient byl odeslán od svého všeobecného zubního lékaře na další vyšetření bělavé léze na přilehlé dásni a související peri-implantitidy. Panoramatický snímek ukazuje generalizovanou ztrátu alveolární kosti a usazeniny vápenatých solí v peri-implantitické oblasti (č. 42, č. 43, č. 44) a pravá oblast předních a premolárních zubů v oblasti implantátu vykazovala ztrátu krestální kosti peri-implantitické oblasti. Laboratorní nálezy byly v normálním rozmezí. Všechny ostatní situace, kdy dochází ke zvýšení hladiny onkogenních proteinů, včetně užívání tabáku a/nebo alkoholu, žádné nutriční nedostatky, žádné nálezy expozice ionizujícímu záření, žádné imunodeficience nebo imunosupresiva a další podráždění způsobené odstraněním protézy, byly vyloučeny. Bělavá léze byla vyříznuta a vzorek byl odeslán ústnímu patologovi. Kontaminovaný povrch implantátu byl ošetřen laserem. Patologická diagnóza byla potvrzena jako orální kandidóza. Pacient podstoupil třikrát laserovou léčbu peri-implantitické léze. O rok později byly jeho implantáty v oblasti č. 42, č. 43 a č. 44 odstraněny z důvodu peri-implantitidy na místní klinice. Podle dopisu z místní kliniky byl systém implantátu typu s vnitřním třením, který měl povrch SLA a byl instalován před více než 10 lety. Asi o 3 roky později po laserové operaci byla na linguální straně oblasti #43 a #44 zjištěna vyboulená hmota. Byla provedena incizní biopsie a byla diagnostikována jako SCC (obr. ). Byl proveden další průzkum včetně laboratorních testů, RTG hrudníku, EKG, MRI, kontrastního CT, PET-CT a sonografie krku. Pacient byl diagnostikován jako cT4aN2cM0 ve stadiu IVA podle TNM systému navrženého Americkým společným výborem pro rakovinu (AJCC, 2018). Byl okamžitě naplánován na operaci, která zahrnovala selektivní disekci krku, resekci nádoru s marginální mandibulektomií a rekonstrukci s radiálním předloktím bez laloku. Konečná patologická zpráva byla dobře diferencovaný spinocelulární karcinom, s nádorem o velikosti 1,5 × 2,0 cm, bez metastáz do kteréhokoli z 27 regionálních lymfatických uzlin a s jasným chirurgickým resekčním okrajem. Nebyla pozorována žádná vaskulární ani perineurální invaze; byl tedy diagnostikován jako pT1N0M0, stupeň I. Zvláště, než na rozhraní mezi implantátem a kostí, se nádorové buňky objevily nejprve na povrchu měkké tkáně sliznice a pronikly hluboko podél implantátových vláken. Pacientovi nebyla podána žádná adjuvantní radioterapie ani chemoterapie. Metastatický lymfatický uzel byl nalezen na pravé ipsilaterální úrovni IV na zesíleném CT, které bylo pořízeno 4 měsíce po operaci. Byla provedena selektivní disekce krku včetně pravé úrovně IV a na pravé čelisti byl nalezen nově vyvinutý podezřelý nádor. Nález na čelisti byl potvrzen biopsií řezné rány; proto pacient podstoupil další operaci 13 dnů po druhé selektivní disekci krku (obr. ). Závěrečná patologická zpráva o nádorové lézi na čelisti byla dobře diferencovaný SCC o velikosti 2,0 × 1,4 cm; hloubka invaze byla 0,7 cm. Byla přítomna i nádorová ložiska v podkoží. Okraje chirurgické resekce byly čisté. Chirurgicky odebrané vzorky byly fixovány v 10% neutrálním pufrovaném formolinu, zpracovány podle běžného protokolu a byly také připraveny sériové mikrořezy s různými antisérami pro imunohistochemické barvení. Všechny datové soubory pacientů byly vybrány ze souborů Ústavu ústní a maxilofaciální chirurgie, Stomatologické nemocnice Seoul National University, a to na základě schválení institucionální revizní rady Seoul National University (S-D20170026). Krev pacienta byla odebrána před operací, 10 dnů po operaci a 3 měsíce po operaci. Po srážení při pokojové teplotě byly vzorky centrifugovány při 4000 ot/min po dobu 20 minut. Byly odebrány pouze supernatanty a ty byly smíchány s lyzisovým pufrem a použity pro IP-HPLC. Použili jsme 100 μg každého proteinového extraktu k imunoprecipitaci pomocí proteinové A/G agarózové kolony (Amicogen Co., Korea). Proteinové A/G agarózové kolony byly před použitím samostatně inkubovány s 1 μg každého z 20 různých antisér, včetně p53, muc1, muc4, TGF-β1, survivin, Wnt1, E-cadherin, β-catenin, matrixová metaloproteináza (MMP)-3, MMP-10, TNFα, HER1, HER2, PAI-1, NRAS, KRAS, CEA, Met, FASL a ERb. Stručně řečeno, proteinové vzorky byly smíchány s 5 ml vazebného pufru (150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,2 mM vanadátu, 0,2 mM PMSF a 0,5 % NP-40) a inkubovány v proteinových A/G agarózových kolonách při 10 °C po dobu 1 hodiny. Sloupce byly umístěny na rotační míchací zařízení během inkubace. Po promytí každého sloupce dostatečným množstvím PBS roztoku (pH 7,3, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 43 mM Na2HPO4-7H2O a 1,4 mM KH2PO4) byl cílový protein eluován 150 μl IgG elučního pufru (Pierce Co., USA). Immuoprecipitované proteiny byly analyzovány pomocí HPLC (1100 series®, Agilent, USA) za použití reverzní fáze kolony a mikroanalytického detektorového systému (SG Hightech Co., Korea), který byl provozován s 0,15 M NaCl a 20 % acetonitrilovým roztokem při 0,4 ml/min po dobu 30 minut a analyzován pomocí UV spektroskopie při 280 nm. Ve výsledcích IP-HPLC byly použity vzorky proteinových píků získané z analýzy HPLC v negativní kontrole k eliminaci píků protilátek (mAU*s) [–]. Pro porovnání sérových proteinů před operací a po operaci byly hodnoty proteinových píků proporcionálně normalizovány podle hodnoty alfa-tubulin a byly znázorněny jako sloupce. Z nádorové tkáně byly připraveny proteinové extrakty, 100 μg každého proteinového extraktu pro imunoprecipitaci za použití protein A/G agarosové kolony. Protein A/G agarosové kolony byly individuálně předinkubovány s 1 μg každého z 9 různých antisér, včetně TNFα, NRAS, HER2, Met, E-cadherin, p53, survivin, TGF-β1 a NFκB. Stručně řečeno, proteinové vzorky byly smíchány s 5 ml vazebného pufru (150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,2 mM vanadátu sodného, 0,2 mM PMSF a 0,5% NP-40) a inkubovány v protein A/G agarosových kolonách při 10 °C po dobu 1 h. Pro porovnání proteinových hodnot normálních dásní a SCC tkání byly hodnoty proteinových vrcholů proporcionálně normalizovány podle hodnoty alfa-tubulin a byly znázorněny jako sloupec. Shromáždily se rutinní laboratorní výsledky včetně kompletního krevního obrazu (CBC) s diferenciálním počtem, hladiny C-reaktivního proteinu (CRP) a sedimentace erytrocytů (ESR). Mírné zvýšení plazmatické hladiny CRP v rozsahu pozorovaném u zdánlivě zdravých jedinců je silným prediktorem budoucích vaskulárních příhod. [] Chen et al. [] uvádějí, že přítomnost zvýšené předoperační hladiny CRP v séru (> 5,0 mg/l) je nezávislým prognostickým ukazatelem rakoviny ústní dutiny. Výsledky z testů krevních vzorků byly porovnány z první návštěvy, předoperačně, pooperačně a v době recidivy. Analýzy pomocí IP-HPLC odhalily, že hladiny p53, E-cadherin, β-catenin, MMP-10, HER2, NRAS, Met a ERb se snížily v 10. pooperačním dni. Hladiny dalších proteinových markerů souvisejících s onkogenní signalizací se zvýšily v 10. pooperačním dni. To naznačuje, že onkogenní proteiny, jako jsou p53, E-cadherin, β-catenin, MMP-10, HER2, NRAS, Met a ERb, byly uvolněny z primárního nádoru; hladiny těchto onkogenních proteinů proto v séru poklesly po nádorem ablativní operaci (obr. ). Za 3 měsíce pooperačně byly hladiny všech onkogenních proteinových markerů zvýšené a bylo podezření na recidivu nádoru nebo metastázy (obr. ). Analýzy pomocí IP-HPLC odhalily, že NRAS, Met, p53 a NFκB byly v porovnání s hladinami onkogenních proteinů mezi normální dásní a tkáněmi SCC nadměrně exprimovány (obr. Zánětlivé markery, jako je počet bílých krvinek (WBC), absolutní počet neutrofilů (ANC), ESR a CRP, byly bezprostředně po operaci zvýšené. CRP nebyl před operací proveden, a proto tyto údaje nelze porovnávat s jinými časovými body; hladiny CRP se však před a po druhé operaci významně nezměnily (pravá úroveň IV selektivní disekce krku, doplňující soubor: obrázek S1). Zejména počet ESR byl zvýšen v předoperačním období, jak bylo stanoveno, když byl maligní nádor potvrzen řeznou biopsií a byl porovnán se vzorkem odebraným při první návštěvě. To naznačuje, že některé zánětlivé reakce mohou ovlivnit potenciál maligní transformace. Perioperační změny v RBC, hemoglobinu a hematokritu ukázaly, že hladiny byly během pooperačního období sníženy, ale časem se začaly obnovovat (Další soubor: obrázek S2). Podíl segmentovaných neutrofilů se zvýšil bezprostředně po operaci, což jsou charakteristické buňky akutních zánětlivých reakcí, protože se přesunuly do chirurgické rány bezprostředně po traumatu během několika minut. Grafické křivky lymfocytů, monocytů, eozinofilů a bazofilů ukázaly opačné trendy než hladiny segmentovaných neutrofilů (Další soubor: obrázek S3).