10letá fena jorkšírského teriéra o hmotnosti 2,1 kg byla přijata do místní nemocnice s dušností. Přítomnost perikardiální tekutiny byla potvrzena ultrazvukem, který byl poté odebrán pod ultrazvukovým vedením, a fyzikální a chemické vlastnosti perikardiální tekutiny byly zkoumány za účelem určení jejich vlastností. Bakteriální a houbové kultivační testy přinesly negativní výsledky, což znamená, že nedošlo k růstu. Nebyly zjištěny žádné abnormality v kompletním krevním obraze a chemickém složení séra. Pacient byl odeslán do Veterinární fakultní nemocnice Kangwonské národní univerzity. Celkem 30 ml perikardiální tekutiny bylo odebráno z oblasti, kde byla pod ultrazvukovým vedením s lokální anestezií pozorována; intravenózně bylo podáno 1 mg/kg (0,2 ml) alfaxalonu, po němž následovalo dalších 0,1 ml. Po 10–15 minutách bylo podáno 4 ml 2% lidokainu zředěného v solném roztoku (1:1). Krvavý perikardiální výpotek byl rozmazaný a bylo provedeno cytologické vyšetření. V cytologickém vyšetření byly pozorovány binucleace, anizocytóza, anisokaryóza, abnormální nukleoly (velké, hranaté a vícenásobné), hojná bazofilní cytoplazma, vysoký poměr jádra a cytoplasmy (N:C) a hrubá chromatinová vlákna a velké atypické mnohočetné buňky, což naznačuje vysoce maligní nádor. Tyto buňky lze nalézt buď jako jednotlivé nebo jako shluky agregovaných s určitým počtem erytrocytů. Vedle těchto buněk byly pozorovány četné nedegenerativní neutrofily a makrofágy. Byla pozorována erytrofagie, což naznačuje chronické krvácení (obr. A–C). Rozlišení mezi reaktivními mezoteliálními buňkami a mezoteliomem v perikardiální tekutině je náročné, zejména v přítomnosti zánětu bohatého na neutrofily. Proto se autor snažil zjistit, zda byly pozorované buňky reaktivní mezoteliální, mezoteliomové nebo adenokarcinomové buňky pomocí imunocytochemie s použitím pěti markerů (cytokeratin, vimentin, desmin, E-cadherin a kalretinin) [, –] Immunocytochemie byla provedena úpravou metody doporučené výrobci protilátek; mesotheliomové buňky jako pozitivní kontrola pro každou z primárních protilátek byly připraveny z uložených buněk z nátěru, které byly odebrány z psa, u kterého byl po smrti diagnostikován mesotheliom. V té době byly mesotheliomové buňky rozmazány a fixovány v methanolu po dobu 10 minut a byly uloženy ve skleněné nádobě obsahující 1x fosfátový pufrovaný fyziologický roztok (PBS) při 4 ℃ po dobu několika měsíců. Pro barvení kalretininu a E-cadherinu byly buněčné nátěry z perikardiálních výpotků fixovány v methanolu při teplotě -20 °C po dobu 10 minut a třikrát promyty PBS (Sigma-Aldrich, Burlington, MA, USA) po dobu 2 minut. Primární protilátky proti kalretininu (1:1000, Sigma C7479; hostitel: králík; reaktivita: lidská, myší, psí) a anti-E-cadherin, Alexa Fluor 594 (10 µg/ml, Biolegend 147,306; hostitel: potkan; ověřená reaktivita: myší, lidská; hlášená reaktivita: cynomolgus, pes, prase), byly zředěny 1% bovinní sérovou albumin (BSA)/PBS (Komabiotech, Soul, Jižní Korea). Po přes noc inkubaci s primárními protilátkami při teplotě 4 °C byly destičky třikrát promyty PBS po dobu 2 minut. Sekundární protilátka Alexa Fluor 488 (10 µg/ml, Invitrogen, A11034) kozí anti-králíkový imunoglobulin G (IgG; těžký + lehký řetězec [H + L]) byl zředěn 1% BSA/PBS. Po přes noc inkubaci s sekundárními protilátkami při teplotě 4 °C byly destičky třikrát promyty PBS po dobu 2 minut. Destičky byly poté kontrastníbarveny montážním médiem obsahujícím DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) a byly zkoumány pomocí laserového skenovacího konfokálního mikroskopu LSM 780 (Carl Zeiss, Jena, Německo). Pro barvení cytokeratinu a vimentinu byly použity monoklonální protilátky proti pan cytokeratinu (AE1/AE3), eFluor™ 570 (1 µg/ml, Invitrogen 41-9003-82, Carlsbad, CA, USA), vimentinu (V9) a fluoresceinu (1 µg/ml, Invitrogen 11-9897-82); stejný protokol (způsob barvení nebo potřebný čas) jako je popsán výše byl proveden s použitím jiného sekundárního protilátky. Pro zbarvení desminu bylo jako primární protilátka použito monoklonální protilátka proti desminu (D33) (1:100, Invitrogen MA5-13259) a jako sekundární protilátka byl použit kozí anti-myší IgG (H + L) Alexa Fluor 488 (1:500, Invitrogen A28175). Byly provedeny stejné postupy, jako jsou popsány výše. Immunocytochemie perikardiální tekutiny byla pozitivní na vimentin (obr. A) a cytokeratin (obr. B). DAPI (obr. C) a sloučený obraz z obr. A–C jsou uvedeny na obr. D. Byla také pozitivní na desmin (obr. E). DAPI (obr. F) a sloučený obraz z obr. E, F jsou uvedeny na obr. G, H. Konečně byla pozitivní na kalretinin (obr. A) a E-cadherin (obr. B). DAPI (obr. C) a sloučený obraz z obr. A–C jsou uvedeny na obr. D. Proto byl diagnostikován zhoubný mezoteliom [,, –].