La pacient és una nena d'onze anys, nascuda tres setmanes abans del compte per cesària a causa d'una posició transversal, amb un pes en néixer de 2.720 g. No va tenir dificultats d'alimentació en la infància ni després. El desenvolupament motor i del llenguatge va ser retardat: va començar a caminar sense ajuda als dos anys i mig i va dir les seves primeres paraules als tres anys. Als deu anys ja coneixia l'alfabet i va intentar unir les lletres. Va fer servir bolquers fins als vuit o nou anys. El seu patró de son és lleugerament irregular amb freqüents desvetllaments. Mai s'ha detectat cap malformació congènita o epilèpsia. Té una alçada normal amb una longitud al llarg del percentil 25-50 i un pes al llarg del percentil 25, però el seu perímetre cranial ha estat en el rang normal inferior (percentil 2,5-5). Les seves característiques facials també són normals - no és clarament dismòrfica. El comportament és normal sense trets autistes, però el bruxisme és un problema. Prefereix la companyia de nens més joves. El seu nivell intel·lectual es considera comparable a un ID lleu-moderat, encara no s'ha fet un test formal d'IQ. Als nou anys, la seqüenciació de l'exoma complet (WES) va revelar una variant de NAA10 (NM_003491.3) c.332 T > G p.V111G de novo que es va confirmar amb la seqüenciació de Sanger. En línia amb altres variants de NAA10 sense sentit, la substitució V111G afecta un aminoàcid altament conservat. NAA10 és una proteïna de 235 aminoàcids que adapta el plec GNAT característic comú a les subunitats catalítiques NAT. Aquest plec consisteix en sis o set cadenes β i quatre hèlixs α. Les cadenes β 2-5 constitueixen el nucli de la proteïna. Aquestes quatre cadenes β, juntament amb l'hèlix α2 i el bucle β6-β7 important per a la unió del substrat, estan altament conservades. V111 es troba cap al final de la cadena β5, i una valina en aquesta posició està altament conservada en els homòlegs de NAA10 així com en altres subunitats catalítiques NAT per a les quals s'han resolt les estructures cristal·lines, 4U9W (NAA40), 3FTY (NAA50), 5ICV (NAA60) i 4LX9 (ssNAT)) [–]. La cadena lateral de V111 forma una butxaca hidrofòbica juntament amb Y145, M147, L119 i L109. També es troba molt a prop (3.7 Å) del grup de sofre d'Acetil-CoA (AcCoA), la qual cosa podria indicar un paper per a V111 en la posició d'AcCoA. Una glicina en aquesta posició no causarà cap conflicte estèric, però la pèrdua de la cadena lateral hidrofòbica més voluminosa de valina possiblement causarà alteracions estructurals que afectaran l'estabilitat de la proteïna o la unió d'AcCoA. Per avaluar funcionalment la NAA10-V111G, primer vam expressar la His/MBP-NAA10-WT i la His/MBP-NAA10-V111G en E. coli, vam purificar els enzims i vam provar l'activitat NAT in vitro. A diferència de la His/MBP-NAA10-WT, era difícil obtenir una bona expressió de la proteïna de la His/MBP-NAA10-V111G, i una fracció important de les molècules de la His/MBP-NAA10-V111G purificades es va eluir en el volum mort de la columna de cromatografia d'exclusió per mida. Això indica que parts de la proteïna s'agrupen en unitats més grans de 200 kDa, probablement a causa d'una alteració de l'estructura de la proteïna o una reducció de l'estabilitat de la proteïna. Es va provar l'activitat catalítica dels enzims que es van eluir en un volum de columna corresponent a la His/MBP-NAA10-V111G monomèrica i es va demostrar que tenien una reducció d'aproximadament el 85% de l'activitat catalítica en comparació amb la His/MBP-NAA10-WT. A causa dels baixos nivells d'expressió i rendiment de proteïnes de NAA10-V111G d'E. coli transfectades i la purificació de proteïnes, es va transfectar cèl·lules HeLa amb plasmidis que codifiquen NAA10-V5 o NAA10-V111G, seguits d'immunoprecipitació (IP) de la proteïna sobreexpressada amb un anticòs anti-V5. A continuació, es va mesurar l'activitat NAT en el precipitat. NAA10 i NAA15 formen un complex de proteïnes d'alta afinitat, i com s'esperava, la NAA15 endògena es va co-immunoprecipitar tant amb la NAA10-V5 sobreexpressada com amb la NAA10-V111G-V5. La quantitat de NAA10 i NAA15 presents en cada mostra es va determinar mitjançant SDS-PAGE i Western blot. Les bandes del Western blot es van quantificar, i l'activitat catalítica mesurada es va correlacionar amb la quantitat de NAA10-V5 present en la mostra (és a dir, una barreja de NAA10 monomèric i NAA10 en complex amb NAA15 - el complex NatA), i es va correlacionar per separat amb la quantitat de NAA15 present en la mostra (és a dir, la quantitat del complex NatA només). Els resultats de l'experiment d'activitat IP es van correlacionar bé amb la nostra troballa anterior: la capacitat de NAA10-V111G per acetilar el N-terminal àcid EEEI24 es va reduir en gran mesura. No obstant això, també va revelar una segona característica interessant: com es pot veure en el Western blot de la Fig., més NAA15 es va co-immunoprecipitar amb NAA10-V111G-V5 en comparació amb NAA10-WT-V5. Això també es va reflectir en els nostres mesuraments d'activitat NAT, on la mostra d'immunoprecipitat de NAA10-V111G-V5 va mostrar una major formació de producte NatA (per al polipèptid del substrat NatA SESS24) en comparació amb la mostra d'immunoprecipitat de NAA10-WT-V5 quan es va correlacionar amb la quantitat total de NAA10-V5 present en la mostra. No obstant això, quan es correlaciona amb la quantitat de NAA15 present en cada mostra, la formació de producte NatA per NAA15 és aproximadament igual. Com que el monòmer NAA10 té una activitat NAT 1000 vegades menor cap als substrats NatA en comparació amb el complex NatA [], la contribució del monòmer NAA10 a l'acetilació de SESS24 és mínima. En conjunt, això suggereix que NAA10-V111G ha reduït l'activitat catalítica en una forma monomèrica, però no en un complex amb NAA15. Per avaluar el recanvi de proteïnes de NAA10-WT i NAA10-V111G, hem expressat NAA10-V111G-V5 en cèl·lules HeLa i hem fet experiments de seguiment de cicloheximida. Com es pot veure a la figura, NAA10-V111G-V5 té un recanvi més alt que NAA10-WT-V5. Dues hores després del tractament amb cicloheximida, la quantitat mitjana de NAA10-V111G-V5 s'havia reduït aproximadament un 80%, mentre que les molècules de NAA10-WT-V5 s'havien reduït un 20% en relació amb la quantitat de molècules de NAA10 abans del tractament amb cicloheximida. Tot i que la quantitat de NAA10-V111G-V5 es va reduir dràsticament després de dues hores, el nivell de NAA10-V111G-V5 sembla estabilitzar-se al voltant del 20%. El més probable és que la sobreexpressió de NAA10-V111G-V5 és present tant en una forma monomèrica inestable que es degrada ràpidament com en un complex amb NAA15, que estabilitza l'enzim i el protegeix de la degradació.