Es va derivar un gos pastor alemany mascle d'11 anys d'edat a la unitat d'urgències del Departament de Ciències Clíniques d'Animals de Companyia de la Facultat de Medicina Veterinària de la Universitat d'Utrecht amb una història de 2 dies de dispnea aguda i debilitat generalitzada. La vacunació i la desparasitació es van fer regularment. El gos havia visitat el sud d'Europa 6 mesos abans de la presentació. No es van administrar fàrmacs abans del desenvolupament dels signes clínics i no es van reportar circumstàncies ambientals que poguessin causar dispnea (per exemple, tabac, exposició a dissolvents orgànics, pols). L'examen físic va mostrar un gos reactiu però letàrgic amb debilitat generalitzada, dispnea severa, membranes mucoses cianòtiques, temps de farciment capil·lar prolongat, polsos perifèrics febles, taquicàrdia (freqüència cardíaca 180 batecs/min) i un murmuri sistòlic de grau un de sis amb el punt d'intensitat màxima sobre l'àpex cardíac dret. Es van escoltar sons pulmonars durs en l'auscultació pulmonar. El recompte sanguini complet (CBC) va mostrar una leucocitosi madura lleu (glòbuls blancs: 18.9 × 109/L; interval de referència 4.5–14.6 × 109/L) i un hematòcrit del 56% (interval de referència 42–61%). La bioquímica no va mostrar cap anormalitat. L'anàlisi de gasos arterials va mostrar una hipoxèmia severa (PaO2: 48.5 mm Hg; interval de referència 85–103 mm Hg) i una hipocapnia lleu (PaCO2: 27.0 mm Hg; interval de referència: 32–43 mm Hg). La sospita de la causa de la hipocapnia va ser la hiperventilació. Les concentracions de dímer D i antitrombina estaven dins dels intervals de referència. L'anàlisi d'antígens de Dirofilaria immitis (SNAP® Heartworm RT Test, IDEXX Laboratories) i l'examen fecal (tècnica d'aïllament de larves per flotació i Baermann) van ser negatius. Les radiografies toràciques van mostrar una dilatació del tronc pulmonar i una cardiomegàlia dreta L'ecocardiografia es va veure molt complicada per l'ansietat severa i el panteix del gos i, per tant, es va limitar. Es va observar una dilatació severa del ventricle dret, una dilatació uniforme lleu de l'artèria pulmonar principal, un aplanament sistòlic del septe interventricular i una regurgitació tricuspidal moderada. L'aplicació de l'equació de Bernoulli modificada a la velocitat del raig de regurgitació tricuspidal va mostrar una pressió sistòlica estimada de l'artèria pulmonar de 77 mm Hg, classificada com a PH severa (referència < 25 mm, PH severa > 75 mm Hg) ([]). Les dimensions del ventricle esquerre es van reduir notablement, d'acord amb l'esgotament del volum del costat esquerre. Es va realitzar una ecografia de contrast salí, que va ser negativa, i per tant es va descartar la derivació intra i extracardíaca dreta-esquerra. Per fer front a la hipoxèmia severa i la PH, el gos es va col·locar en una gàbia d'oxigen amb una concentració d'oxigen inspirat entre 40 i 50%. A més, es va administrar 1,5 mg/kg/8 h de sildenafil oral (Viagra®, Pfizer, Nova York, EUA) i 0,25 mg/kg/12 h de pimobendan oral (Vetmedin®, Boehringer Ingelheim, Alemanya). Aquesta teràpia no va afectar significativament l'estat clínic del gos. Tot i això, la hipoxèmia arterial va millorar lleument després del primer dia de teràpia (PaO2 va augmentar de 48,5 a 53 mm Hg, interval de referència 85-103 mm Hg). L'ecocardiograma es va repetir el tercer dia de teràpia i els canvis ecocardiogràfics i la gravetat de la PH van disminuir notablement. La dilatació del ventricle dret havia disminuït dràsticament, el septe interventricular ja no estava aplanat i el gradient de pressió de la regurgitació tricuspidal va disminuir de 77 mm Hg a 41 mm Hg (interval de referència < 25 mm Hg). Per tant, la teràpia amb pimobendan i sildenafil es va continuar durant el període d'hospitalització (7 dies). Es van realitzar altres passos diagnòstics, una tomografia computada (TC) (pre-i post-contrast) amb una apnea, seguida d'una biòpsia pulmonar quirúrgica en la mateixa sessió d'anestèsia 4 dies després de la presentació inicial. Es va fer servir un escàner de TC helicoïdal d'un sol tall (Philips Secura, Philips NV, Eindhoven, Països Baixos). Els ajustos tècnics van incloure talls helicoïdals de 3 mm, 120 kV, 200 mA, 292 mm de camp de visió, matriu de 512 × 512 i un algoritme d'alta freqüència espacial. A les imatges de TC, el parènquima pulmonar va mostrar nòduls subtils de vidre en el centre i una artèria pulmonar engrandida. Les línies septals, el vessament pleural i la limfadenopatia estaven absents. Les troballes de la TC eren compatibles amb PH sense un diagnòstic concloent. Després de la tomografia computada, es va prendre una biòpsia pulmonar del lòbul pulmonar cranial esquerre (3 × 2 cm) per a un examen histopatològic amb una mini-toracotomia. Directament després d'aquest procediment es va iniciar una teràpia amb dexametasona (0.25 mg/kg q24 h I.V., Rapidexon ®, Eurovet Animal Health, Bladel, Països Baixos) com a últim recurs mentre es trobaven pendents els resultats histopatològics (3 dies). La histopatologia de la biòpsia pulmonar quirúrgica va mostrar una pneumònia histiocítica intersticial crònica moderada d'etiologia desconeguda i atelèctasi per hematoxilina i eosina, àcid periòdic-Schiff i tincions de Van Gieson. Inicialment, els canvis vasculars no es van identificar clarament. A causa de la poca resposta al tractament iniciat i el sospitós mal pronòstic basat en els resultats histopatològics, el gos va ser eutanasiat. Es va realitzar una autòpsia amb el consentiment informat del propietari. La patologia macroscòpica dels pulmons va mostrar pulmons col·lapsats moderadament amb un aspecte difús clapejat amb múltiples focus vermells foscos d'1 × 1 × 3 mm, i petits números de focus blancs d'1 × 1 × 1 mm, sovint envoltats per una zona vermella fosca (demarcació) distribuïda aleatòriament per tots els lòbuls pulmonars. La histopatologia rutinària dels pulmons va mostrar remodelació vascular multifocal. Per diferenciar entre artèries i venes petites, essencial per diagnosticar la malaltia pulmonar venooclusiva, es va afegir una tinció que visualitzava les fibres elàstiques i el col·lagen (resorcin Fuchsin de Weigert) per identificar les làmines elàstiques. En aquest gos, com en les persones amb malaltia pulmonar venooclusiva, es van veure afectats els tres compartiments (artèries, venes i capil·lars) de la microcirculació pulmonar, tot i que els canvis en el sistema venós pulmonar van ser els més pronunciats. Les lesions venulars van incloure una proliferació intimal concèntrica severa, l'obliteració parcial o completa de les llumeneres i la recanalització post-trombòtica. Les lesions capil·lars es van organitzar en focus, més evidents adjacents a les venules remodelades i es van caracteritzar per la proliferació de les cèl·lules endotelials plomoses (similars a les PCH). La congestió segmentària dels capil·lars alveolars també es va associar regularment amb els focus de PCH. Les lesions arterials s'assemblaven a les de la HAP amb un engrossiment intimal concèntric per l'augment de la matriu extracel·lular i la hipertròfia medial, però les lesions plexiformes complexes estaven absents. Aquestes troballes eren consistents amb les troballes descrites per Williams et al. [] i, per tant, l'equivalent humà de la malaltia pulmonar venooclusiva. El DNA genòmic del cas es va aïllar de sang amb EDTA usant un robot d'extracció Chemagen semiautomatitzat (PerkinElmer Chemagen Technologie GmbH) i es va emmagatzemar a − 20 °C. Aproximadament 6 anys després, el DNA genòmic del cas i un GSD sa no relacionat es van analitzar mitjançant seqüenciació del genoma complet. Es va comprovar la integritat del DNA en un Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, EUA) i es va quantificar usant Qubit dsDNA HS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA). Es van preparar biblioteques de DNA usant el kit de preparació de biblioteques TruSeq Nano (kit de preparació de biblioteques TruSeq Nano, Illumina, San Diego CA, EUA) usant 200 ng d'entrada de gDNA. Es va obtenir informació de seqüenciació del genoma complet amb una cobertura de 30× usant un instrument HiSeqX Ten (instrument HiSeqX Ten, Illumina, San Diego CA, EUA) i 2 × 150 lectures de parells de bases. Les dades es van processar amb la nostra canonada desenvolupada internament v1.2.1 () que inclou anàlisi de mutacions somàtiques (Strelka, VarScan, FreeBayes i MuTect) i un kit d'eines d'anàlisi del genoma (GATK v. 3.2.2) [] d'acord amb les directrius de millors pràctiques [] Les lectures de seqüència es van assignar al genoma de referència caní (CanFam 3.1) utilitzant l'alineació de Burrows-Wheeler amb les coincidències exactes màximes (BWA-MEM) v0.7.5a [] seguida de duplicats marcats, fusió de carrils i realineació d'indels. No es va realitzar el recalibratge de la base. En la medicina humana, s'ha suggerit que les mutacions en BMPR2, ACVRL1, ENG, KCNK3, CAV-1 i SMAD9 són causants d'una forma autosòmica dominant de PAH []. Aquests gens es van incloure en les anàlisis per evitar la manca de variants de mutacions candidates a causa d'una classificació fenotípica errònia. En comparar el cas i el control, l'anàlisi d'aquests gens va revelar 196 variants intròniques úniques. En comparar la seqüència d'EIF2AK4 en el cas i el GSD sa es van revelar 124 variants úniques, de les quals 9 es van localitzar a la 3'UTR, 112 eren variants intròniques i 3 eren exòniques. El cas era homozigot mutant per c.2961T>C i c.1266G>A, es va trobar una variació heterozigòtica a c.2092G>A. La validació de la variant es va realitzar mitjançant seqüenciació Sanger en productes amplificats de reacció en cadena de la polimerasa d'ADN genòmic utilitzant Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). Després del tractament amb exonucleasa I, es van realitzar reaccions de seqüenciació d'ADN utilitzant BigDye v3.1 en, seqüenciat en un ABI3130XL i analitzat a Lasergene (versió 12.0 DNASTAR). Quatre dels cinc GSD addicionals, desconeguts per a qualsevol forma d'estrès respiratori i amb una edat ≥ 10 anys, van revelar el genotip idèntic al cas i, per tant, es van excloure com a variants causants de PVOD.