Una llúdriga eurasiàtica mascle de 4 anys nascuda el 2015 al 'Sendaviva, Natural Park of Navarra' (42°11′31″N, 1°09′54″O) (Nord-est d'Espanya) va ser traslladada al parc de vida salvatge 'Terra Natura' (Sud-est d'Espanya) el 2017. El parc de vida salvatge 'Terra Natura' es troba als voltants de la ciutat de Múrcia (38°00′40″N, 1°09′54″O). El recinte de les llúdrigues consistia en una zona amb refugis d'accés lliure i un estany amb 4 animals d'aquesta espècie (2 mascles i 2 femelles). No es va aplicar cap insecticida anti-mosquits a les llúdrigues. L'agost de 2019 l'animal va presentar epistaxi bilateral, anorèxia, apatia i pèrdua de pes. L'animal va ser sedat abans de la manipulació amb medetomidina (0.2 mg/kg/i.m.) i ketamina (20 mg/kg/i.m.). Es va extreure sang sencera per punció venosa de la vena cefàlica, es va drenar en un tub d'1 ml recobert amb àcid etilendiaminotetraacètic (EDTA) i un tub d'1 ml sense anticoagulant per a un recompte complet de cèl·lules sanguínies (CBC) i anàlisis bioquímiques, respectivament. El CBC es va realitzar en un compdador de cèl·lules sanguínies (ADVIA 120 Hematology System, Siemens, Itàlia), i les anàlisis bioquímiques es van realitzar en un analitzador bioquímic automatitzat (Olympus AU600 Automatic Chemistry Analyzer, Olympus Europe GmbH, Hamburg, Alemanya). A més, es va prendre orina per a una anàlisi d'orina guiada per ultrasò. Es va realitzar un estudi ecogràfic del cor i els òrgans abdominals, inclosos els ronyons, la melsa, el fetge, la vesícula biliar, el pàncrees i el sistema digestiu. Com que els resultats bioquímics i ecogràfics eren compatibles amb la leishmaniosi clínica, es van realitzar proves serològiques i moleculars per confirmar la presència de la infecció. La presència d'anticossos IgG2 anti-Leishmania es va avaluar en el sèrum de la llúdriga mitjançant un assaig immunofluorimètric resolt en el temps (TR-IFMA) realitzat com es descriu per Cantos-Barreda et al. []. Per tal de comprovar que l'assaig TR-IFMA validat per al sèrum de gossos es pot aplicar al sèrum de llúdria, es va realitzar un Western blot. El Western blot es va realitzar en sèrums de llúdria amb signes compatibles amb leishmaniosi i d'un gos seropositiu per Leishmania mitjançant TR-IFMA. Els sèrums (dilució 1:2000) es van separar en condicions reductores en mini gels de poliacrilamida (0,1% de dodecil sulfat de sodi (SDS), 12% de gel de resolució i 4% de gel apilador). Les proteïnes resoltes es van transferir electroforèticament a una làmina de nitrocel·lulosa (Bio-Rad, EUA) i es van col·locar en un substrat ROTI®Lumin (Carl Roth, Alemanya) per bloquejar durant 2 h a temperatura ambient. L'anticòs policlonal anti-IgG2 de gos (AHP498; Bio-Rad, EUA) a una dilució 1:1000 es va usar com a anticòs primari, mentre que l'anticòs anti-IgG2 de cabra conjugat amb peròxid d'hidrogen (HRP) (SAB3700702; Sigma-Aldrich, EUA) a una dilució 1:1000 es va usar com a anticòs secundari per detectar l'anticòs primari unit. La detecció del senyal es va fer usant un kit Pierce ECL2 (Pierce, Thermo Fisher Scientific, EUA) i es va digitalitzar en un escàner Typhoon 9410 (GE Healthcare, EUA). Es va observar una banda d'aproximadament 150 kDa tant en la mostra de llúdria com en la mostra de gos (vegeu la figura i l'arxiu addicional). Aquestes troballes corroboren que l'assaig TR-IFMA usant anticòs policlonal anti-IgG2 de gos va ser capaç de detectar la IgG2 de la llúdria. L'assaig TR-IFMA va consistir en un mètode indirecte no competitiu basat en l'antigen recombinant K39 biotinilat com a reactiu de captura i l'anticòs policlonal anti-IgG2 de gos (anticòs anti-IgG2 de gos, Bio-Rad, EUA) Eu3 +-etiquetatge com a detector. L'assaig va incloure el sèrum d'un gos seropositivo per Leishmania com a control positiu i el sèrum d'un gos seronegatiu per Leishmania com a control negatiu. L'anàlisi es va realitzar en un comptador de múltiples etiquetes (VICTOR2 1420, PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Turku, Finlàndia). Els resultats es van expressar com a unitats de fluorometria per Leishmania (UFL). El tall es va establir en 22 UFL. També es va realitzar un assaig d'immunoabsorbent lligat a enzims (ELISA) (Leiscan® Leishmania ELISA Test, Esteve Veterinaria, Laboratorios Dr. Esteve SA, Barcelona, Espanya) per detectar anticossos específics d'IgG contra Leishmania spp. segons les instruccions del fabricant. Les mostres de sèrum es van diluir 1:20 i els resultats es van expressar com a relació de mostra a positiu (S/P), calculada per la densitat òptica (OD) de mostra/OD de control positiu baix. Els valors de S/P per sobre de 1,1 es van considerar positius. La presència d'ADN de Leishmania spp. en sang total i medul·la òssia es va avaluar mitjançant l'amplificació de la seqüència d'ADN de kinetoplast de Leishmania spp. usant una rtPCR amb encebadors i sondes prèviament descrites []. La medul·la òssia es va extreure mitjançant aspiració amb agulla fina de la unió costocondral i es va drenar en un tub d'1 ml recobert amb EDTA. L'ADN es va extreure usant el kit de preparació de mostres d'alta puresa per a PCR (Roche, Alemanya), seguint les instruccions del fabricant. La rtPCR es va realitzar en un volum final de 20 μl, incloent 1× TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents (VIC Probe) (Exo IPC) (Applied Biosystems, CA, EUA). Es va incloure el control intern. La rtPCR es va realitzar en un volum final de 20 μl, incloent 1× iTaq Universal Probes Supermix (Bio-Rad, CA, EUA), 900 nM de cada encebador, 200 nM de sonda TaqMan, 1× Exo IPC Mix, 1× Exo IPC DNA, i 50 ng d'ADN de cada mostra. Els paràmetres del cicle van ser: 50 °C durant 30 s, 95 °C durant 10 min, 45 cicles a 94 °C durant 30 s, i 55 °C durant 1 min. Cada cicle d'amplificació va incloure controls positius i negatius, i cada mesura es va realitzar per triplicat. Per a la identificació de l'espècie Leishmania, els productes de PCR de les mostres positives es van purificar usant el kit de purificació de productes de PCR d'alta puresa (Roche, Alemanya) i es van enviar per a la seqüenciació a la Secció de Biologia Molecular de la Universitat de Múrcia. Les seqüències obtingudes es van comparar amb les disponibles a GenBank. A més, com a control negatiu, es van fer les mateixes anàlisis a una llúdriga eurasiàtica femella de 3 anys del mateix parc natural sense signes clínics compatibles amb la leishmaniosi. Tots els resultats apareixen a la taula. Es va confirmar l'aparició de leishmaniosi i es va administrar un tractament específic (allopurinol 15 mg/kg/24 h/p.o.). El seguiment del tractament es va fer el novembre de 2019, després de 3 mesos de tractament. Es va observar una nefropatia bilateral amb hidronefrosi, una limfadenomegàlia mesentèrica i una ascites. El recompte de glòbuls blancs i plaquetes va disminuir en la llúdria positiva per Leishmania. El perfil bioquímic sèric de la llúdria positiva per Leishmania va mostrar hiperproteïnèmia, hiperglobulinèmia, disminucions de PON-1 i augments d'haptoglobina i ferritina. L'anàlisi d'orina va revelar proteïnúria i disminucions de l'osmolaritat i la gravetat específica. Es va observar la presència d'anticossos IgG2 anti-Leishmania i un resultat positiu per RT-PCR en sang total i medul·la òssia per a la llúdria positiva per Leishmania. La seqüenciació de mostres positives va confirmar la identificació de L. infantum. La seqüència amplificada va mostrar una similitud del 100% amb una seqüència de referència de L. infantum. A més, es van observar microorganismes ovals amb un nucli excèntric compatible amb els amastigots de Leishmania spp. en la citologia de la melsa (Fig.