Una pacient de 52 anys amb antecedents de colecistectomia i resecció parcial del lòbul hepàtic esquerre el 2004 a causa d'un càlcul biliar simptomàtic i múltiples colelitiasis intrahepàtiques del conducte biliar va presentar febre intermitent i icterícia progressiva des de principis de novembre de 2014. Es va detectar obstrucció del conducte biliar i sospita de neoplàsia hepàtica en una ecografia posterior, una ressonància magnètica per colangiopancreatografia (RMCP), una ressonància magnètica, i una tomografia per emissió de positrons (PET-CT). Es va realitzar una laparotomia exploratòria a finals de novembre de 2014 (arxiu addicional: Figura S1) i es va trobar una adherència intraabdominal severa, un nòdul (1 × 2 cm) amb textura endurida en el conducte hepàtic esquerre proximal, i disseminació de lesions neoplàstiques infiltrant el hilio del conducte hepàtic comú, el lligament hepatoduodenal, els ganglis limfàtics circumdants, l'artèria hepàtica, la vena porta, i l'eix celíac. Aquestes troballes van obligar els cirurgians a renunciar a la resecció radical. Es va drenar bilis purulenta del conducte comú, i un tap de moc va sobresortir de la paret del conducte biliar. Es van extirpar lesions neoplàstiques parcials dels ganglis limfàtics engrandits, el nòdul del lòbul hepàtic esquerre, i la vora de l'artèria hepàtica comuna per a l'examen patològic. Es va instal·lar un drenatge del conducte T per a l'alleujament de l'obstrucció biliar. Els informes patològics van revelar que la naturalesa del tumor era un adenocarcinoma pobrament diferenciat amb marcadors de diferenciació de colangiocits; a més, es va detectar una expressió moderada d'EGFR en >90% de les cèl·lules tumorals. Es va diagnosticar finalment a la pacient com un CCA perihiliar avançat no resecable. Cinc setmanes després de la cirurgia pal·liativa, la pacient va rebre un cicle de 4 setmanes de teràpia TOMO sobre la neoplàsia maligna hilar (DT = 60 Gy/25 F), un cicle de quimioteràpia sistèmica amb paclitaxel unit a albúmina per a les seves intolerables toxicitats gastrointestinals i la infusió de cèl·lules assassines induïdes per citoquines autòlogues. A causa de l'augment progressiu de CA199, es va reexaminar immediatament després de la finalització de la radioteràpia la PET-CT i es va mostrar una nova lesió hipermetabòlica metastàtica en el lòbul caudal hepàtic i una ampliació del teixit tou i metàstasi del gangli limfàtic retroperitoneal amb un valor de captació estàndard anormal (SUV) entre el fetge i l'estómac en comparació amb la PET-CT prèvia a la radioteràpia. Quatre setmanes després de la radioteràpia, la pacient es va inscriure en l'assaig CART-EGFR. El seu estat de rendiment va ser 1 segons els criteris de l'ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group). Durant la preparació de les cèl·lules CART-EGFR, va desenvolupar febre alta, icterícia agressiva, i obstrucció del conducte biliar, acompanyada per l'elevació contínua de CA199 (de 100,5 a 413,5 U/ml), augment agressiu de la bilirubina total, directa, i altres enzims relacionats amb l'obstrucció biliar i es va tractar amb antibiòtics d'ampli espectre eficaços i col·locació d'un stent biliar endoscòpic en els conductes biliars hepàtics. Els assaigs (identificador ClinicalTrials.gov NCT01869166, NCT02541370) van ser aprovats pel Comitè d'Ètica de l'Hospital General de l'Exèrcit Popular d'Alliberament de la Xina. No hi va haver cap patrocinador comercial involucrat en els estudis. Els pacients reclutats van donar el seu consentiment informat per escrit d'acord amb la Declaració d'Hèlsinki. La seqüència d'ADN del fragment de cadena única variable (scFv) que s'adreça a l'antigen EGFR es va derivar de JQ306330.1 (número GenBank). Es va generar i es va clonar en l'esquelet lentiviral pWPT un CAR anti-EGFR scFv-CD137-CD3zeta, que es va descriure en detall per Feng et al. []. La construcció es va verificar mitjançant seqüenciació d'ADN. Es va produir un sobrenant de vector lentiviral pseudotip de grau clínic mitjançant transfecció transitòria estàndard com ho van descriure McGinley et al. [] D'acord amb les instruccions del fabricant del reactiu de transfecció Lipofectamine 3000 (Invitrogen, EUA), es va transfectar el plasmidi pWPT-anti-EGFR CAR, el plasmidi d'empaquetament ps-PAX2 i el plasmidi d'envoltura pMD2.G en cèl·lules 293 T. Es van recollir els sobrenatants lentivirals i es van emmagatzemar a −80 °C. Es va construir el vector GFP-CD137-CD3zeta per verificar l'eficiència de la transducció mitjançant citometria de flux FACSCalibur (BD Biosciences). La seqüència d'ADN de l'scFv que s'adreça a l'antigen CD133 es va derivar de HW350341.1 (número GenBank), la generació, construcció i prova de les cèl·lules CART-EGFR van seguir el mateix procediment que les cèl·lules CART-EGFR (arxiu addicional: Figura S2). Les cèl·lules CART es van fabricar a partir de cèl·lules mononuclears de sang perifèrica autòlogues (PBMC) recollides en tubs de preparació de cèl·lules (BD Biosciences, San Jose, CA) purificades a partir de 80 a 100 ml de sang sencera a la instal·lació de bones pràctiques de fabricació de l'Hospital General de l'Exèrcit Popular Xinès segons els procediments operatius estàndards actuals. Les PBMC es van estimular amb 50 ng/ml anti-CD3 MoAb (Takara, Japó) i 500 U/ml interleucina-2 humana recombinant (Peprotech, EUA) en medi GT-T551 (Takara). La transducció lentiviral es va realitzar en medi GT-T551 amb sulfat de protamina (Sigma) durant 24 h després de 2 dies de cultiu de cèl·lules T. Després d'això, les cèl·lules es van expandir encara més en bosses de cultiu (Takara) i es van recollir com a cèl·lules CART. Es van provar bacteris, fongs i endotoxines abans de la infusió de cèl·lules CART. Es va analitzar l'immunofenotip de les cèl·lules CART mitjançant citometria de flux amb anticossos marcats amb fluorescència específics per a la tinció de CD3, CD4, CD8, CD45RO, CD62L i CCR7. Es van fer servir anticossos monoclonals de l'isotip corresponent (BD Biosciences) per a la tinció de control. Es va estimar l'expressió de CAR basada en les cèl·lules transduïdes amb GFP-CD137-CD3zeta del mateix lot per a tots els pacients mitjançant citometria de flux. L'adquisició i anàlisi de dades es va fer utilitzant una citometria de flux FACSCalibur (BD Biosciences). Es va testar la citotoxicitat in vitro de les cèl·lules CART-EGFR mitjançant el cocultiu amb cèl·lules tumorals positives per a EGFR en diferents relacions efector-objectiu en plaques de 96 pouets utilitzant un kit de detecció CCK-8 de 4 h (DOJINDO, Japó). Es va fer servir la PCR quantitativa a temps real (Q-PCR) per avaluar el nivell del gen de fusió CAR segons un protocol prèviament descrit.13 Es va amplificar un fragment de 153 pb (parells de bases) que contenia parts de la cadena CD8a i la cadena 4-1BB adjacent (l'encebador directe 5′-GGTCCTTCTCCTGTCACTGGTT-3′ i l'encebador invers 5′-TCTTCTTCTTCTGGAAATCGGCAG-3′) mitjançant el sistema de detecció de seqüències ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems). Es va fer servir beta-actina com a control intern. Es va preparar una corba estàndard de 7 punts que consistia en 100 a 108 còpies/μl d'ADN plasmídic que contenia el gen CAR. Es va testar el sèrum IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-12/IL23p40, IFN-γ, TNF-α, VEGF, i Granzyme B utilitzant un immunoassaig de micropartícules de BD Biosciences segons les instruccions del fabricant. Segons el sistema de cultiu descrit anteriorment [], es van generar cèl·lules CART-EGFR a partir de les cèl·lules mononuclears de 80-100 ml de sang perifèrica del pacient i es van alliberar per a les infusions. De les cèl·lules infoses durant el primer cicle de la teràpia CART-EGFR, el 99,14% eren cèl·lules CD3+, compostes principalment pel subgrup CD8+ (62,26%), i el 23,61% es van caracteritzar amb el fenotip de memòria central (CD45RO+/CD62L+/CCR7+). A més, el 8,99% de les cèl·lules infoses eren positives per a l'EGFR. El fenotip i l'eficiència de transfecció de les cèl·lules CART-EGFR infoses en cada cicle es documenten a la taula. Es van generar i cultivar cèl·lules CART133 segons el mateix procediment que les cèl·lules CART-EGFR. De les cèl·lules infoses, el 95,2% eren cèl·lules CD3+, compostes principalment pel subgrup CD8+ (71,9%), i el 41,9% eren cèl·lules CD45RO+/CD62L+/CCR7+. A més, el 6,4% de les cèl·lules infoses eren CD133 positives. Els detalls es documenten a la taula. A causa de la radioteràpia recentment completada en un termini de 2 mesos i la intolerància als agents quimioterapèutics, la pacient va rebre 4 dies d'infusions successives de 2,2 × 106/kg de cèl·lules CART-EGFR en total sense cap tractament de condicionament, i va aconseguir un PR en la seva primera avaluació 6 setmanes després, avaluada segons els criteris d'avaluació de resposta en tumors sòlids versió 1.1 (RECIST 1.1) amb MRI i PET-CT, que va il·lustrar una reducció de més del 80% de les lesions metastàtiques a la regió hepàtica i el lòbul caudat i un notable descens de SUV, juntament amb una disminució ràpida de CA199 de 413,5 a 123,1 U/ml. El nombre de còpies del transgèn CAR a la sang perifèrica de la pacient va assolir un màxim de 5916 pg/dl el dia 9 acompanyat amb l'alliberament de citoquines com ara interleucina-6 (IL-6) i proteïna reactiva C (CRP). El segon cicle de monoteràpia CART-EGFR es va administrar amb una dosi de cèl·lules T que expressen EGFR-CAR+ de 2,1 × 106/kg i sense cap tractament de condicionament perquè el nombre de còpies del transgèn CAR a la sang perifèrica va disminuir prop del nivell basal 2 mesos després de la primera infusió de cèl·lules T genèticament modificades que expressen CART-EGFR. Els exàmens rutinaris de MRI i PET-CT van mostrar un PR persistent acompanyat amb una reducció addicional de CA199 a 61,2 U/ml. És interessant destacar que el pic del nombre de còpies del transgèn CAR després de la segona infusió de cèl·lules CART-EGFR no va assolir un nivell paral·lel o superior al del primer cicle de CART-EGFR. L'estat PR de la pacient es va mantenir durant 8,5 mesos fins que va desenvolupar vòmits freqüents i incontrolables, dolor abdominal superior sord i reflux àcid gàstric, que es va produir a mitjans de novembre de 2015. L'examen electrònic posterior de gastroscòpia va mostrar estenosi del bulb duodenal i el PET-CT va confirmar la progressió del tumor amb la il·lustració de múltiples noves lesions anormals SUV a l'oment major, el peritoneu i la cavitat abdominal. Posteriorament, el pacient va ser tractat amb 1 cicle de teràpia CART-EGFR combinat amb 2 cicles d'anticòs monoclonal anti-proteïna 1 de mort cel·lular programada (PD-1) (Nivolumab, Bristol-Myers Squibb), que es va administrar a una dosi de 100 mg cada 2 setmanes. De la mateixa manera, el nombre de còpies del transgèn CAR monitoritzat en sang perifèrica no va assolir un nivell màxim similar al de la infusió del primer cicle, fins i tot combinat amb anticòs anti-PD-1. Tot i que el CA199 en sèrum va disminuir transitòriament de 326,3 a 210,8 U/ml, el següent PET-CT va detectar metàstasis de nova aparició a la part inferior de la pelvis, el lòbul hepàtic dret i el gangli limfàtic supraclavicular esquerre, així com l'engrandiment de les lesions tumorals prèvies a l'abdomen en comparació amb el PET-CT abans de la immunoteràpia combinada. Com que més del 90% de les cèl·lules tumorals expressaven la proteïna CD133 (arxiu addicional: Figura S3), la pacient es va inscriure en l'assaig CART133 i va rebre la infusió de 1,22 × 106/kg de cèl·lules CART específiques de CD133 sense tractament de condicionament. A causa de l'aparició d'obstrucció al duodè descendent i la infecció persistent i severa del tracte biliar resultant, així com l'abscés hepàtic, que poden interferir amb el nivell de CA199 sèric i es va tractar amb antibiòtics, l'avaluació d'imatge programada es va posposar fins a 2 mesos després de la infusió de cèl·lules CART133, en què la TC realçada amb contrast va mostrar una contracció notable o fins i tot la desaparició d'algunes metàstasis al peritoneu i la cavitat abdominal, portant a una avaluació de PR i hemocultius, que no van donar suport al diagnòstic d'infecció, però mentrestant l'escalada d'IL-6 i CRP i l'augment agut de glutamic-pyruvic transaminase i glutamic-oxalacetic transaminase (>6ULN). Hi va haver unes petites erupcions disperses que van aparèixer a la cuixa esquerra 2 setmanes després de la infusió del primer cicle de cèl·lules CART-EGFR, que gradualment van empitjorar i es van fer evidents i pruriginoses amb la presentació de múltiples erupcions escamoses o lineals que s'estenien des de la cuixa esquerra fins al panxell i es fonien, que es va qualificar 2 segons els criteris de terminologia comuna per a esdeveniments adversos 4.0 (CTCAE 4.0), quan es va complir el segon cicle d'immunoteràpia CART. Les erupcions es van biopsiar amb il·lustració de canvis patològics similars al liquen estriat, com ara la pèrdua d'epidermis parcial, degeneració vacuolar de cèl·lules basals i infiltració de nombrosos limfòcits T a l'epidermis i els seus apèndixs, i es va gestionar amb èxit amb ungüent de tacrolimus. No es va produir hipotensió durant tot el tractament CART-EGFR. Excepte nàusees lleus, vòmits, calfreds, febre i fatiga, no hi va haver altres esdeveniments adversos aguts durant el tractament combinat. Tot i que la caspa va aparèixer i va empitjorar després de la immunoteràpia combinada, no va requerir intervencions mèdiques. Els nivells sèrics de citoquines com ara el factor de necrosi tumoral alfa (TNF-α), IL-6 i CRP es van elevar lleugerament i no van induir cap símptoma d'alliberament de citoquines. Durant la infusió de cèl·lules CART133 en successives dosis durant 4 dies, no hi va haver cap altre esdeveniment advers excepte febre lleu i fatiga relacionades amb la infusió. No obstant això, el segon matí després de la finalització de la infusió de cèl·lules CART133, aquesta pacient va desenvolupar dolor abdominal superior sord intermitent, calfreds, febre (39.1 °C), hemorràgies esporàdiques i erupcions congestives en els seus panxells, que es van estendre ràpidament i difusament al seu coll, braç superior dret, pit, abdomen esquerre i mucosa retrofaríngia acompanyades de pruïja i diarrea aquella mateixa tarda i es van deteriorar encara més en els següents 10 dies i el lligand 1 de la proteïna de mort cel·lular programada (PD-L1) [,], provocant una pèrdua ràpida de la seva capacitat de secreció de citoquines i citòlisi i entrant en un estat d'hiposensibilitat []. A més, els tumors sòlids sovint mostren aberracions metabòliques en consumir de manera excessiva aminoàcids essencials crítics per a l'activitat de les cèl·lules T i indueixen la hipòxia i la consegüent acidificació de la matriu extracel·lular a causa d'un subministrament vascular insuficient hostil a la supervivència de les cèl·lules T []. Així, la modulació del microentorn tumoral és necessària per a millorar els resultats. En aquest cas, tot i que la pacient no va rebre cap tractament condicionant directe amb l'objectiu de transformar el microentorn tumoral, va ser tractada amb 60 Gy de radioteràpia abans de la immunoteràpia amb un interval d'aproximadament un mes des del final de la radioteràpia fins al començament de la infusió de cèl·lules CART. Tot i que la radioteràpia per si mateixa no va aconseguir eradicar de manera efectiva les cèl·lules tumorals, el seu efecte directe i retardat pot tenir un paper en la destrucció de l'estroma de suport del tumor, alterant la biologia del microentorn tumoral, promovent l'alliberament de més antígens associats al tumor i augmentant el reconeixement immune []. A més, la radioteràpia podria fer que els tumors fossin més immunogènics i més susceptibles a un atac millorat per part de les cèl·lules T [], i fins i tot generar efectes antitumorals en aquelles metàstasis distants que no van ser irradiades de manera local (conegut com a efecte abscopal) [, ]. Per tant, plantegem la hipòtesi que la radioteràpia podria ser una teràpia condicionant raonable i efectiva per a millorar el resultat de la teràpia CART. Quan es va confirmar la resistència a la teràpia CART-EGFR, vam provar una vegada una immunoteràpia de combinació amb l'anticòs anti-PD-1 en conjunt amb la infusió de cèl·lules CART-EGFR en base a un estudi preclínic que va demostrar que el bloqueig de la immunosupressió PD-1 podria millorar significativament l'eficàcia terapèutica de la teràpia de cèl·lules CART contra tumors sòlids establerts []. Malauradament, aquest tractament va acabar en fracàs amb un PET-CT que va verificar la progressió de la malaltia, tot i que CA199 va disminuir transitòriament. Una possible explicació és el nivell poc clar d'expressió de PD-L1. Recentment, l'expressió de PD-L1 es destaca pel seu valor en la predicció dels efectes terapèutics dels fàrmacs anti-PD-1. No obstant això, la lesió tumoral en aquest cas era difícil de biopsiar per la seva ubicació anatòmica, el que va provocar que el nivell d'expressió de la proteïna PD-L1 en les cèl·lules tumorals no es pogués detectar amb precisió abans de l'inici de la teràpia anti-PD-1, el que va suposar la possibilitat que l'expressió de PD-L1 en el medi tumoral fos de nivell baix o fins i tot negatiu i, per tant, conduís al fracàs del tractament anti-PD-1. Mentrestant, hi havia moltes altres vies de punts de control paral·lels que podrien donar suport a la resistència a la teràpia anti-PD-1 [] En aquesta situació, la selecció d'un objectiu racional va ser crucial per al següent pas del tractament dels pacients. Recentment, les CSC en CCA han atret molta atenció per les seves propietats altament carcinògenes i els seus rols clau en la mediació de la renovació, el re-creixement del tumor i la resistència terapèutica, per tant, la teràpia que es dirigeix als marcadors moleculars de la superfície i les vies de senyalització específiques de CSC seria una opció potent per a la CCA [, ]. Entre les molècules utilitzades individualment o en combinació per identificar les cèl·lules mare de colangiocarcinoma, CD133 és un dels marcadors de cèl·lules mare més importants que estan associats amb una major invasivitat i un pronòstic més pobre [] Shien i els seus col·laboradors també van informar que les cèl·lules tumorals CD133-positives van mostrar una major resistència al tractament postoperatori que les cèl·lules CD133 negatives, i es va observar un augment de l'expressió de CD133 en les cèl·lules canceroses residuals després de la teràpia adjuvant [] Basant-se en l'anterior, finalment vam seleccionar CD133 com l'antigen diana per a la immunoteràpia CART, que al seu torn va produir una altra resposta parcial, i va demostrar a més que la immunoteràpia CART pot ser factible i racional. Un altre aspecte crucial de gran preocupació va ser la toxicitat, que podria ser induïda per les cèl·lules CART sobre els antígens diana expressats en les cèl·lules tumorals i/o sincrònicament en els teixits normals, denominat efecte diana fora del tumor. El dany als teixits normals pot ocórrer fins i tot per una reacció creuada inesperada amb una proteïna que no s'expressa en les cèl·lules tumorals []. Des de l'inici de la infusió de cèl·lules CART-EGFR, aquest pacient va experimentar no només febre, calfreds i fatiga relacionats amb la infusió, sinó també pirèxia sostinguda, elevació aguda de les transaminases sèriques i aparició tardana d'erupcions cutànies, acompanyades d'una elevació robusta del nombre de còpies del transgèn CAR, IL-6 i CRP, tot i que els nivells no van complir els criteris per diagnosticar la síndrome d'alliberament de citoquines [, ]. Les citoquines massives que podrien ser produïdes directament per les cèl·lules CART infoses reflectien una forta resposta immune que podria generar tant efectes antitumorals sobre les cèl·lules tumorals com efectes secundaris sobre els teixits normals. A més, l'efecte diana fora del tumor causat per les cèl·lules CART-EGFR va ser probablement la raó per a l'activació de toxicitats dermatològiques a causa de la distribució d'EGFR a l'epidermis []. Tanmateix, tots aquests esdeveniments adversos van ser lleus, reversibles i es van gestionar amb cures de suport i corticosteroides tòpics. L'addició d'anticòs anti-PD-1 aparentment no va agreujar les toxicitats de la immunoteràpia CART-EGFR en aquest cas. No obstant això, en el tractament posterior de la infusió de cèl·lules CART133, aquest pacient va patir toxicitats dermatològiques, orals, mucoses i gastrointestinals greus, com ara erupcions i hemorràgies. Tot i que aquestes toxicitats es van gestionar amb èxit mitjançant intervencions mèdiques emergents, inclosa la metilprednisolona intravenosa i l'inhibidor anti-TNF, el mecanisme inherent pot ser degut en gran part a l'efecte diana fora del tumor de les cèl·lules CART133 que es dirigien a l'antigen CD133 expressat en l'epiteli normal i l'endoteli vascular. Mentrestant, no estava clar si l'anticòs anti-PD-1 i les cèl·lules CART-EGFR residuals in vivo podrien tenir un paper en el deteriorament de les toxicitats de la immunoteràpia CART133.