Aquest pacient era un home de 22 anys amb B-ALL que havia patit una recaiguda de la medul·la òssia (BM) abans de la inscripció en el nostre protocol clínic compassiu usant cèl·lules TanCAR-T 19. Se li va diagnosticar B-ALL amb més de 100 × 109/L de recompte de WBC i cariotip normal al gener de 2016. Després de la remissió completa (CR) 2, es va sotmetre a un haplo-HSCT del seu pare 10 mesos després del diagnòstic original. Havia patit una cistitis hemorràgica i GVHD aguda gastrointestinal de grau 1 en els 2 mesos posteriors al haplo-HSCT, que es va resoldre amb 15 dosis diàries de 50 mg de metilprednisolona seguides de 5 dosis diàries de 100 mg de metilprednisolona. Tres mesos després de la interrupció de la ciclosporina A i la metilprednisolona, la seva malaltia va recaure amb un 6,4% de blasts de la medul·la òssia quan encara tenia un quimeri de donant complet, després va progressar ràpidament amb un 56,5% de blasts de la medul·la òssia per flux citomètric 10,6 mesos després del haplo-HSCT, i es va documentar un quimeri de donant indetectable al mateix temps. Va rebre quimioteràpia de rescat amb MOEP (3 dosis diàries de mitoxantrona 10 mg, vindesina 4 mg, 3 dosis diàries d'etopòsid 100 mg, i 5 dosis diàries de 15 mg de dexametasona) i va tenir una depressió de la medul·la òssia greu i cap resposta amb un 65,4% de blasts de la medul·la òssia 1 mes després del primer cicle de MOEP. Després, es va tractar amb el nostre protocol de cèl·lules haplo-CAR-T 19. Va rebre quimioteràpia de citoreducció amb vindesina i metilprednisolona més hidroxiurea i teràpia de limfodepleció amb daunorrubicina i ciclofosfamida, i els seus blasts de la medul·la òssia van disminuir a un 12,7% abans de la infusió de cèl·lules haplo-CAR-T 19. Les cèl·lules haplo-CAR-T 19 a una dosi de 4,91 × 106/kg (2,89 × 107 T cells/kg, 17% d'eficiència de transfecció) es van administrar i van induir MRD-CR (MRD-CR) i quimeri de donant indetectable en 2 setmanes després de la infusió. Les cèl·lules haplo-CAR-T 19 infoses van exhibir una expansió ràpida i van aconseguir un màxim de 15.281 còpies per microgram d'ADN en els primers 2 dies després de la infusió, però van disminuir de 3374 còpies per microgram d'ADN el dia 7 a 468 còpies per microgram d'ADN el dia 12; es van usar 160 mg de metilprednisolona i 5 mg de dexametasona el dia 11 per al tractament de la síndrome de grau 3 de l'alliberament de citoquines (CRS). Va experimentar GVHD aguda de la pell de grau 3 en el termini d'1 mes després de la infusió de cèl·lules haplo-CAR-T 19, que estava sota control amb 5 dosis diàries de 40 mg de metilprednisolona més 80 mg de ciclosporina A administrades a partir del dia 31 després de la infusió de cèl·lules haplo-CAR-T 19. No obstant això, 1 mes després d'obtenir MRD-CR, la seva malaltia va exhibir una florida de la progressió amb un recompte de WBC que augmentava de 1,59 × 109 a 12,52 × 109/L i el corresponent percentatge de blasts circulants que augmentava de 1,39 a 67,37% en 2 setmanes; la seva medul·la òssia va exhibir una proliferació cel·lular altament activa amb 59,67% de blasts que tenien el patró d'expressió CD19+ CD34+ CD10+ CD22+ CD38+ CD58+ CD33- CD20- CD13- CD15-. Al mateix temps, es va documentar un quimeri de cèl·lules haplo-CAR-T 19 indetectable i quimeri de donant. En aquest cas, altres teràpies incloent TanCAR-T 19/22 cèl·lules en lloc de la quimioteràpia de rescat o la reinfusió de CAR-T 19 cèl·lules podrien ser una opció de tractament potencial per a aquest pacient a causa de la poca resposta a la quimioteràpia de rescat i la poca persistència de les cèl·lules CAR-T 19 infoses. Tot i això, la càrrega tumoral elevada i l'interval curt després de la interrupció de l'esteroide van incrementar el risc de fracàs de la generació de cèl·lules CAR-T autòlogues; la progressió florida de la malaltia va fer que esperar fins que l'esteroide es va reduir fos menys factible. La teràpia amb cèl·lules TanCAR-T 19/22 derivades de donants va ser una estratègia òptima per a superar aquest problema, però, com és ben sabut, les teràpies amb cèl·lules haplo-CAR-T no s'havien de recomanar de manera rutinària en el context d'una GVHD prèvia que requerís esteroides, principalment a causa de la preocupació elevada pel risc alt de reactivació de la GVHD. Després d'una consideració més acurada dels beneficis clínics i els riscos de la segona infusió de cèl·lules haplo-CAR-T, es va inscriure en el nostre protocol clínic compassiu usant cèl·lules haplo-TanCAR-T 19/22. El seu pare es va sotmetre a afèresi, i les cèl·lules mononuclears de sang perifèrica (PBMC) es van usar per preparar les cèl·lules TanCAR-T 19/22. Va rebre quimioredució amb vindesina 4 mg i cinc dosis diàries de metilprednisolona 80 mg i tres dosis diàries d'hidroxiurea 3 g seguides d'una quimioteràpia de limfodepleció amb idarubicina a una dosi total de 30 mg i ciclofosfamida a una dosi total de 3 g. L'aspiració de medul·la òssia planificada després de la quimioteràpia esmentada i abans de la infusió de cèl·lules haplo-TanCAR-T 19/22 no es va realitzar a causa de la manca de compliment del pacient. Dos dies després, es va tractar amb cèl·lules haplo-TanCAR-T 19/22 a una dosi total de 4,72 × 106 TanCAR-T 19/22 cèl·lules per quilogram (3,05 × 107 T cèl·lules per quilogram, 15% eficiència de transfecció) administrades mitjançant dosificació fraccionada (D0, 30%; D1, 70%) per consideracions de seguretat. Els materials i mètodes utilitzats en la producció de TanCAR-T 19/22 s'han descrit anteriorment [–], amb l'excepció de la construcció del CAR i la font de PBMC utilitzada per a la fabricació de les cèl·lules TanCAR-T 19/22. TanCAR-19/22 era una molècula CAR en tàndem, que consisteix en un scFv anti-CD22 derivat de l'mAb m971 de ratolí [] i un scFv anti-CD19 derivat de l'mAb FMC63 de ratolí [], units en tàndem, la frontissa CD8a humana i el domini transmembrana, i els dominis de senyalització CD137 i CD3z humans. A la figura a es mostra un esquema de TanCAR-19/22. Les PBMC utilitzades per a la fabricació de les cèl·lules TanCAR-T 19/22 es van recollir per leucaferesi en lloc de sang perifèrica (PB) fresca. Es va fer servir la citometria de flux per a la determinació de l'eficiència de la transfecció de TanCAR-19/22 i la quantificació de les cèl·lules haplo-TanCAR-T 19/22 en mostres clíniques usant un fragment específic de biotina-SP-AffiniPure anti-IgG de cabra, F (ab') 2 (Jackson ImmunoResearch, EUA) i un anticòs anti-PE Streptavidin (BD Biosciences, EUA). Les cèl·lules haplo-TanCAR-T 19/22 en mostres clíniques també es van mesurar per qPCR com s'ha descrit []. L'abast de l'empelt del donant en mostres clíniques es va avaluar utilitzant l'amplificació de repeticions curtes en tàndem i la PCR múltiple amb marcatge fluorescent combinada amb l'electroforesi capil·lar, tal com es descriu []. Es van analitzar els nivells de sèrum d'interleucina (IL)-2, IL-6, IL-8 i IL-10 i del factor de necrosi tumoral alfa per lots tal com s'ha descrit []. El protocol de cèl·lules BM abans de l'haplo-TanCAR-T 19/22 va mostrar una majoria de blasts amb absència de precursors de la medul·la òssia normals. La citometria de flux de la medul·la òssia el dia 14 després de la infusió d'haplo-TanCAR-T 19/22 va indicar que hi havia un 0,73% de blasts residuals. Cal destacar que aquests blasts leucèmics residuals van mostrar el patró d'expressió CD34+ CD10+ CD22+ CD38+ CD33+ CD19− CD20−, que no es va detectar mitjançant la citometria de flux el dia 28 en absència de teràpia posterior. Atès que la recuperació incompleta de les plaquetes i el recompte absolut de neutròfils el dia 28, aquest pacient va aconseguir un MRD-CRi el dia 28 després de la infusió. No hi va haver evidència de blasts a la medul·la òssia mitjançant frotis de la medul·la òssia o mitjançant citometria de flux en punts temporals posteriors durant 14 mesos. La medul·la òssia va tenir una reconstitució de la hematopoesi normal el dia 56 amb l'excepció del recompte de plaquetes que encara no s'havia recuperat a un nivell de 36 × 109/L en el moment d'aquest informe. Es va establir un quimisme complet del donant el dia 14 després de la infusió i es va mantenir estable a partir d'aleshores. Després de la infusió, les cèl·lules haplo-TanCAR-T 19/22 es van expandir i van assolir un nivell màxim del 30,7% de les cèl·lules T circulants el dia 12, seguit d'una fase de contracció amb un nivell baix del 0,45% de les cèl·lules T circulants el dia 28. Això va coincidir amb l'eliminació de les cèl·lules B circulants, que eren gairebé indetectables el dia 28 per citometria de flux. Les cèl·lules haplo-TanCAR-T 19/22 encara es podien mesurar amb un nivell baix del 2,29% de les cèl·lules T circulants i les cèl·lules B circulants encara no s'havien recuperat en el moment d'aquest informe. Les cèl·lules haplo-TanCAR-T 19/22 també eren presents per citometria de flux en tots els punts temporals d'avaluació de la resposta en la BM obtinguda en l'avaluació de la resposta, i es va documentar l'aplàsia crònica de cèl·lules B. Es va observar una concordança global entre l'expansió i la persistència de les cèl·lules haplo-TanCAR-T 19/22 en PB mesurades per citometria de flux i qPCR. En el moment d'aquest informe, l'ADN de TanCAR-19/22 encara era detectable per qPCR amb 1134 i 396 còpies per microgram d'ADN en PB i BM, respectivament. Després de la infusió de cèl·lules haplo-TanCAR-T 19/22, va experimentar un CRS de grau 3 segons l'escala de classificació UPenn [, ]. La febre de fins a 38,8 °C es va produir en les 24 hores posteriors a la infusió de cèl·lules haplo-TanCAR-T 19/22, va durar 11 dies i va esdevenir afebril el dia 12 després del tractament amb una dosi inferior de tocilizumab de 160 mg (1,6 mg/kg) i etanercept 50 mg el dia 8. Les citoquines sèriques múltiples havien augmentat notablement 7 dies després de la infusió i gairebé van tornar als valors basals el dia 41, on els nivells d'interleucina (IL)-6 van assolir un màxim de 3377 pg/mL (88 vegades per sobre del valor basal) el dia 11. L'aspartat aminotransferasa i la lactat deshidrogenasa es van elevar significativament de 8 a 10 dies després de la infusió, van assolir un màxim de 1529.1 U/L (38 vegades per sobre del valor superior normal) i 2027.8 U/L (13 vegades per sobre del valor basal) el dia 12, respectivament, i van tornar als valors basals el dia 21 amb el millor tractament de suport. També va exhibir una disfunció de la coagulació amb un temps de tromboplastina parcial activat prolongat, D-dimer elevat i concentracions de fibrinogen caigudes, així com fuga capil·lar amb hipoalbuminèmia de grau 2 malgrat la suplementació intensiva de proteïnes durant el CRS, que es va resoldre el dia 23. La fase prèvia 3 de la GVHD aguda de la pell que estava sota control es va reactivar i va progressar ràpidament a la fase 4 de la GVHD de la pell amb aparició de noves úlceres cutànies locals, en particular a la pell de l'escrot i la mucosa oral 11 dies després de la infusió de cèl·lules haplo-TanCAR-T 19/22. La concentració de bilirubina total en el sèrum va augmentar de manera constant a partir del dia 12 i va augmentar a 134 μmol/L el dia 21. Donada la progressió ràpida de les manifestacions de la GVHD de la pell i la implicació del fetge, es va implementar una dosi més baixa de metilprednisolona a 20 mg diàriament com a dosi inicial amb posterior reducció en un esforç per equilibrar els beneficis i els riscos de la immunosupressió sistèmica a partir del dia 21 i es va interrompre el dia 39. L'erupció cutània i la bilirubina total en el sèrum van millorar significativament després d'aquests tractaments. No obstant això, les manifestacions de la GVHD intestinal de fase 3, que inclouen principalment diarrea, van ocórrer a partir del dia 50, i la bilirubina total en el sèrum va augmentar de nou, suggerint una GVHD aguda de grau 3. Es van administrar setze dosis de metilprednisolona 20 mg diàriament a partir del dia 78, controlant significativament la diarrea i la bilirubina total en el sèrum. Aquest pacient va exhibir posteriorment una GVHD crònica moderada que es va manifestar principalment com a esclerodèrmia, diarrea i pèrdua de pes. La trombocitopènia persistent amb recompte de plaquetes que oscil·la entre 15 × 109 i 43 × 109/L sense transfusió de plaquetes es va poder reconèixer com una manifestació de GVHD crònica en el context de la reconstitució de l'hematopoesi normal. El tractament immunosupressiu sistèmic es va reduir en 2 mesos amb 4 mg de metilprednisolona cada dos dies i 5 mg de metotrexat un cop per setmana i 1 mg de sirolimus diàriament com a dosi mínima de manteniment des del dia 154 fins al moment d'aquest informe, mantenint la GVHD crònica sota bon control.