L'any 1996 es va diagnosticar a una dona de 47 anys (pes: 62 kg) una hepatitis B crònica activa HBeAg-positiva. Es van mesurar simultàniament els paràmetres virals com ara HBeAg, anti-HBe IgG i la càrrega viral plasmàtica del VHB a partir de mostres congelades per un sol operador per reduir les variacions intra i interassaig. L'HBeAg i l'anti-HBe es van determinar per electroquimioluminescència (ELECSYS 2010, Roche Diagnostic). Els nivells de càrrega viral del VHB es van determinar per PCR en temps real (COBAS TaqMan Roche Molecular Systems, rang dinàmic de 30 IU/ml a 110.000.000 IU/ml) []. La inflamació hepàtica es va mesurar pels nivells d'alanina aminotransferasa sèrica (ALT). Per a l'anàlisi de la seqüència, es van seqüenciar els gens pol i preC-core del VHB amb els encebadors descrits anteriorment []. L'anàlisi es va realitzar utilitzant un instrument ABI3100 (Applied Biosystems), i les seqüències introduïdes en aquest treball així com les obtingudes de la base de dades GenBank es van aliniar amb ClustalX v1.83 [] i es van editar amb Bioedit v7.0.9.0 [] El genotip del VHB es va avaluar mitjançant inferència filogenètica utilitzant l'algoritme Neighbor-joining amb el model Kimura-two-parameter model of molecular evolution en el programari MEGA v3.1 [] Es van obtenir seqüències d'ambdós gens en diferents punts temporals durant la teràpia antiviral. Es va realitzar una anàlisi clonal més detallada del gen pol del VHB en set aïllats virals seleccionats de mostres de sèrum recollides durant teràpies seqüencials. Cada producte de PCR seleccionat del gen pol es va clonar en el vector pGEM-T Easy segons les instruccions del fabricant (Promega, Wisconsin, EUA) i es van analitzar almenys 15 clons mitjançant seqüenciació. Això va permetre analitzar l'evolució de les quasi-espècies virals sota les successives pressions antivirals basades en l'anàlisi del gen pol. Les intervencions de tractament anti-HBV acompanyades de la càrrega viral d'HBV i la cinètica del nivell ALT es representen a la figura. La teràpia es va iniciar quan la càrrega viral d'HBV va pujar a 6.5 × 106 IU/ml. L'any 1998, quan el pacient va ser tractat amb IFN-alfa 5 MU tres cops per setmana durant 30 setmanes, el nivell d'ADN d'HBV va ser inferior al límit de detecció. Aquesta teràpia es va interrompre i es va substituir l'any 1999 per lamivudina (150 mg un cop al dia). Després de 2 anys de tractament continu, l'ADN d'HBV va ser detectable (15.5 × 106 IU/ml). HBeAg va romandre negatiu amb anti-HBe detectable durant aquest període de tractament. L'any 2001, després d'una interrupció de 6 mesos, el nivell d'ADN d'HBV va evidenciar un brot post-tractament (1 × 108 IU/ml). Al final de 2003 es va reintroduir la teràpia amb lamivudina (150 mg un cop al dia). Es va acompanyar d'un esdeveniment rar de reversió a un perfil HBeAg positiu/anti-HBe negatiu, que va romandre detectable durant dos anys. La càrrega viral va arribar a 3.1 × 106 IU/ml en aquest punt. Deu mesos després, el 2006, el règim de lamivudina es va substituir per adefovir monoteràpia (10 mg/dia). Inicialment, els nivells de càrrega viral eren baixos (8.5 × 104 IU/ml) però després de 48 setmanes de teràpia aquests nivells van arribar a 7.15 × 106 IU/ml. Els nivells d'ALT eren normals durant aquest interval. Es va assumir la reactivació de la replicació del VHB considerant la detecció simultània d'HBeAg/anti-HBe [] i l'alta replicació detectada. La concurrència d'HBeAg i anti-HBe no sembla ser poc comú entre els pacients que no han rebut tractament antiviral, però la seva prevalença en pacients amb experiència en teràpia és desconeguda. Aquest patró serològic s'ha relacionat amb un dany hepàtic extens i una lesió hepàtica immunomediada greu i la conseqüent disfunció [] Sis mesos després, el nivell d'ALT va augmentar lleugerament (1.5 × límit superior normal - UNL -) i es va iniciar la monoteràpia amb entecavir (1 mg diàriament). Després de 5 mesos de monoteràpia amb entecavir, es va afegir tenofovir (300 mg un cop al dia) al règim de tractament per a la doble teràpia. L'ADN del VHB va disminuir a 1 × 105 IU/ml durant quatre mesos, però tres mesos després la càrrega viral va arribar a > 1.1 × 108 IU/ml. A més, un augment en el nivell d'ALT (20 × UNL) va denotar inflamació hepàtica. Durant les següents 48 setmanes, la replicació viral va disminuir lleugerament a 6.1 × 106 IU/ml però va repuntar primer a 3.6 × 107 IU/ml i després a > 1.1 × 108 IU/ml. Més recentment (segon semestre de 2010), els nivells d'ADN del VHB van fluctuar entre 4.3 × 104 IU/ml i 4.9 × 107 IU/ml. Al final del seguiment de l'estudi, vam poder mesurar la concentració de tenofovir en plasma per cromatografia de líquids d'alt rendiment en tres mostres consecutives 20 hores després de l'administració, que va arribar a 71.6 ng/ml ± 47.6 (mitjana ± SD). Els nivells ALT-AST es van mantenir lleugerament elevats (2x UNL) durant els últims dos anys de seguiment. Els aïllats de HBV del pacient s'atribuïren al genotip A2 basant-se en la relació filogenètica entre les seqüències genòmiques parcials de HBV dels gens pol i preC-C. Una anàlisi genotípica longitudinal addicional, incloent la composició de quasi-espècies de les soques de HBV aïllades del pacient, va revelar la presència de mutacions de resistència basades en les seqüències del gen pol (Taula). Al començament del tractament amb lamivudina, el HBV era de tipus salvatge en tots els clons. Després de 2 anys de teràpia, aquesta població viral va ser completament substituïda per la mutació rtM204I - que mostrava homogèniament resistència a la lamivudina. Quan es va interrompre aquesta teràpia durant 6 mesos, la composició de quasi-espècies consistia gairebé exclusivament en seqüències de nucleòtids pol de tipus salvatge, excepte per una contribució menor (< 10%) que mostrava la mutació associada a la resistència a l'adefovir I233V. Un cop es va reintroduir la teràpia amb lamivudina, i fins que es va administrar entecavir més tenofovir, es van detectar invariablement les mutacions rtL180M i rtM204I associades a la resistència a la lamivudina. En aquest últim esquema terapèutic, només es van detectar les mutacions rtL180M i T184L associades a la resistència a la lamivudina i a l'adefovir, respectivament, de manera efímera i amb una contribució menor (~5%). A més, es van detectar dues variants addicionals en el domini catalític de la transcriptasa inversa en el moment de la resistència a la lamivudina. Aquestes variants rtA200V i rtI253V van romandre presents durant la teràpia amb entecavir, i també es van detectar en mostres seqüenciades després de la interrupció durant la teràpia amb entecavir. La caracterització genòmica del VHB a nivell preC-C va mostrar la presència de la doble mutació A1762T i G1764A que es va detectar precoçment quan el pacient no estava tractat, i va romandre en aquest estat durant tot el seguiment. La mutació T1753C també es va detectar de manera consistent. La presència d'aquestes mutacions del promotor central també està relacionada amb el perfil concurrent HBeAg-antiHBe esmentat anteriorment que es va trobar en aquest pacient, com s'ha publicat recentment [].